WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Клинико- морфологическая и молекулярно-генетическая характеристика больных первичными лимфомами кожи

На правах рукописи

Скрек Сергей Владиславович

КЛИНИКО- МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

БОЛЬНЫХ ПЕРВИЧНЫМИ ЛИМФОМАМИ КОЖИ

14.01.10.- кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2011 г.

Диссертация выполнена на кафедре дерматовенерологии и косметологии ГОУ ДПО «Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Разнатовский Константин Игоревич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Игорь Анатольевич Ламоткин

доктор медицинских наук, профессор Валерий Викторович Дубенский

Ведущее учреждение:

Российсий университет дружбы народов, г. Москва

Защита состоится «____» ______________2011г. в 12.00. на

заседании Диссертационного совета Д208.115.01 при Федеральном Государственном учреждении «Государственный научный центр дерматовенерологии Росмедтехнологий» по адресу: 107076, г. Москва, ул. Короленко, д.3, стр.6

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий».

Автореферат разослан «____» ______________2011г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

кандидат медицинских наук Наталия Константиновна Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Лимфомы кожи составляют 2% от всех кожных заболеваний дерматологического профиля и по частоте встречаемости занимают второе место среди экстранодальных лимфом (Криволапов Ю.А., Леенман Е.Е., 2006).

Данные, касающиеся эпидемиологии Т-клеточных эпидермотропных лимфом кожи, весьма вариабельны. В Соединенных Штатах Америки с 1972 по 1992 гг. зарегистрировано 0,36 х 105 случаев заболеваемости первичными лимфомами кожи. В конце 90-х годов было зарегистрировано такое же количество случев данного заболевания (Bachelez H., 2007). По данным Carli P. M., Boutron M. C., Maynadie M., et al. (1994), за последние 20 лет число больных Т-клеточными лимфомами кожи, регистрируемых национальным институтом рака США, значительно увеличилось, достигнув 100 тыс. случаев в год. По данным ряда авторов (Burg G. et al., 1984; Zackheim H.S. et al., 2000; Burg G. et al., 2005; Willemze R. et al., 2005), ежегодный прирост заболеваемости лимфомами кожи в Соединенных Штатах Америки и в Европе составляет 3-4%.

Частота синдрома Сезари в США составляет 30-40 новых случаев в год. Грибовидный микоз преобладает у пациентов во второй половине жизни, превышая 0,1/105 случаев до 30 лет и 1/105 случаев после 60 лет. Также в мировой литературе имеются данные о преобладании в 1,5-2 раза заболевания у мужчин (Grob J.J., 2005). Уровень смертности 0,065/105 случаев имеет значительную тенденцию к снижению с 1979 года, а с 1991 года регистрируется еще более выраженная динамика в сторону снижения. В Западной Европе в 1980-89 годы ежегодный прирост заболеваемости неходжкинскими лимфомами составил 10,9% (Kim E.J., Hess S., Richardson S.K., et al., 2005).

По данным отечественной литературы, в регионе Санкт-Петербург - Ленинградская область за последние 25 лет заболеваемость лимфомами кожи возросла в 6,5 раза (Ильин Н.В.с соавт., 2006); в Донецкой области за 15 лет - в 20 раз; в Республике Беларусь за 13 лет - в 1,8 раза (Разнатовский И.М., Ястребов В.В., 1997 г). При этом следует учесть, что у частиь больных заболевание правильно не диагностируется, так как практические врачи недостаточно знакомы с симптомами лимфом кожи.

Действующая в настоящее время в большинстве европейских стационаров и клиник Петербурга, Европейская классификация WHO- EORTC (Всемирная Организация Здравоохранения-Европейская Организация по Изучению и Лечению Рака) первичных лимфом кожи, требует дополнительного уточнения клинических проявлений грибовидного микоза, т.к. этот диагностический критерий имеет основопологающее значение для врачей-дерматологов в тактике ведения больных с первичными кожными лимфомами (Ламоткин И.А., 2006).

В настоящее время полиморфизм клинической картины, особенно первичных Т-клеточных лимфом кожи и их опухолевой прогрессии, требует глубокого научного анализа, поиска адекватных диагностических алгоритмов, эффективной лечебно-реабилитационной тактики и новых организационно-методических решений (Ламоткин И. А., Тарасенко Ю. Г., 2005). Решение проблемы диагностики и лечения больных, страдающих онкологическими заболеваниями кожи, в настоящее время приобретает первостепенное значение. Оно обусловлено не только ростом показателей заболеваемости и смертности населения, но и крайней противоречивостью взглядов на вопросы этиологии, патогенеза, диагностики и лечения больных лимфомами кожи (Bagot M., 2005 )

В то же время внедрение в практику таких современных технологий, как моноклональная терапия и молекулярно-генетические методы исследования, в значительной степени дополняющих и объективизирующих клиническую картину заболевания, позволяет осуществлять диагностику и лечение первичных лимфом кожи с использованием новых фармакологических препаратов еще на ранних стадиях заболевания (Bachelez H., 1999).

Учитывая актуальность проблемы оптимизации диагностики, лечения и прогнозирования опухолевой прогрессии первичных лимфом кожи, было предпринято настоящее исследование.

Цель исследования: Динамическая оценка клинического течения, гистологических и иммуногистохимических изменений, также молекулярно- генетической картины у больных первичными лимфомами кожи с последующим проведением сопоставительного анализа информативности различных методов исследования.

Задачи исследования:

  1. Оценить диагностическую значимость клинического метода исследования у больных первичными лимфомами кожи.
  2. Оценить диагностическую значимость морфологического (гистологического и иммуногистохимического) метода исследования у больных различными формами лимфом кожи.
  3. Оценить диагностическую значимость молекулярно- генетического метода исследования у больных различными формами лимфом кожи.
  4. Оценить возможность использования метода иммуногистохимии в качестве прогноза течения заболевания.
  5. Оценить влияние крупных анапластических клеток в инфильтрате больных грибовидным микозом на дальнейший прогноз заболевания.

Научная новизна

Установлено, что наиболее значимыми клиническими симптомами у больных различными формами лимфом кожи являются пятна с «твердой текстурой» (88%), бляшки, разрешающиеся с одной стороны и прогрессирующие с другой (41%), папулы с некрозом (91,5%), диссеминированные папулы в области конечностей (32,5%) или солидные высыпания в области головы (51,5%).

Появление в клеточном инфильтрате крупных анапластических клеток в 20 % случаев наблюдается при ассоциации грибовидного микоза с CD30 лимфопролиферациями.

Установлено, что молекулярно- генетический метод является наиболее информативным в диагностике синдрома Сезари.

Практическая значимость:

На основе совокупной оценки данных клинической картины, гистологических, иммунологических и молекулярно-генетических исследований разработан диагностический алгоритм для выявления больных первичными лимфоми кожи на ранних стадиях заболевания.

Высокая диагностическая значимость клинического метода диагностики первичных лимфом кожи позволяет рекомендовать его для дифференциальной диагностики данных заболеваний в качестве приоритетного метода.

Разработана унифицированная карта для всесторонней клинической оценки поражения кожного процесса, основанная на уточнении особенностей развития заболевания, его течения и отражении изменений в динамике наблюдения и ведения лечебного процесса.

Предложенная классификация первичных лимфом кожи WHO-EORTC 2005 года может быть успешно использована в практической деятельности врачей дерматологов.

Основные научные положения, выносимые на защиту:

1.Наиболее информативным методом диагностики лимфом кожи на ранней стадии является клинический метод диагностики. Лабораторные методы диагностики, такие как морфологический (гистологический и иммуногистохмический), молекулярно- генетический методы являются уточняющими и позволяют верифицировать диагноз на более поздних стадиях.

2. Наиболее информативным методом диагностики среди лабораторных исследований является морфологический метод (гистологический и иммуногистохимический), в то время как молекулярно- генетический метод информативен в 100% случаев лишь при синдроме Сезари.

3. Выявление у больных грибовидным микозом таких признаков, как потеря несколькими лимфоцитами одного или нескольких пан-Т-клеточных антигенов (CD2, CD 3, CD 4, CD 7), наблюдаемая в 19 случаях (30%) или появление маркеров, не свойственных данным лимфоцитам (CD8+) - в 17случаях (27%), является признаком опухолевой прогрессии и свидетельствует о поздних стадиях заболевания или об ухудшении в течении заболевания.

5. Появление у больных грибовидным микозом в клеточном инфильтрате крупных анапластических клеток с положительной экспрессией CD30 является следствием трансформации грибовидого микоза в крупноклеточную анапластическую лимфому кожи CD30+ или ассоциацией грибовидного микоза с CD30+ лимфопролиферациями.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XI Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов (Екатеринбург, 2010г.), III Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики и терапии трудноизлечиваемых заболеваний кожи» (Санкт-Петербург, 2007 год), неоднократно обсуждались на пленарных заседаниях Санкт-Петербургского научного общества дерматовенерологов имени Тарновского (Санкт-Петербург, 2007, 2009 гг.), заседании французской группы по изучению лимфом кожи (GFELC, Кретей, 2009 год), Семинаре Марк Ларег (Гренобль, 2009 год).

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в лекционный курс кафедры дерматовенерологии СПб МАПО и врачей ординаторов, городского кожно-венерологического диспансера Санкт-Петербурга, дерматологического отделения научно-исследовательского института медицинской микологии им. П.Н. Кашкина.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 1 в журнале, входящем в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий», рекомендуемых ВАК РФ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В первой главе приведен обзор специальной литературы по изучаемой проблеме. Первый раздел главы содержит сведения об их частоте, причинах развития, клинических проявлениях и классификациях. Обращено внимание на многообразие рабочих классификаций, разработанных в последние годы и их несостоятельность, описаны нозологические формы первичных лимфом кожи. В дальнейших главах описаны методы исследования для диагностики лимфом кожи и основные сложности постановки диагноза. Также отражена проблема диссоциации в подходах к проблеме лимфом кожи между врачами различных специальностей - онкологов, гематологов, дерматологов и морфологов.

Во второй главе «Материал и методы исследования» представлены таблицы количественного распределения 165 пациентов с различными видами первичных лимфом кожи, реарранжировка пациентов в зависимости от возраста и пола, длительности заболевания (Табл.1).

Таблица 1.Распределение больных с различными видами лимфом кожи по полу и возрасту (абс./ %)

Возраст Всего Из них
абс. % мужчин женщин
абс. % абс. %
21-35 12 7,27 7 4,24 5 3
36-50 38 23,03 26 15,75 12 72,72
50-65 72 43,64 41 24,84 31 18,78
65-79 43 26,06 28 16,96 15 9
Итого: 165 100,0 102 61,81 63 38,18

Среди пациентов было 102 (61,8%) мужчин и 63 (38,1%) женщины. Наибольшее число обратившихся оказалось в возрасте от 50 до 65 лет - 72 человека (43,64%). В целом состав пациентов по возрасту варьировал от 21 до 79 лет. Все пациенты были подразделены на две основные группы: I – пациенты с первичными Т- клеточными лимфомами (128 человек, 77,5%); II – пациенты с первичными В- клеточными лимфомами (37 человек, 22,4%).

Клиническая характеристика больных. Для всесторонней клинической оценки поражения кожного процесса была разработана унифицированная карта обследования, основанная на уточнении особенностей развития заболевания, его течения и отражении изменений в динамике наблюдения и ведения лечебного процесса.

Всем пациентам проводили клинические и физикальные методы исследования. Клинические методы включали оценку таких признаков, как площадь очага поражения, его локализация, характеристика первичного элемента кожной сыпи, полиморфизм кожной сыпи, вовлечение лимфатических узлов, а также анализ динамического наблюдения за течением кожного процесса.

Морфоогическое исследование. Морфологическое исследование включало в себя гистологическое и иммуногистохимическое исследование. Гистологические исследования проведены у всех 165 пациентов с дальнейшим иммуногистохимическим исследованием инфильтрата и определением клональности инфильтрата.

Диагностическая биопсия участка эпидермиса, дермы и подкожно-жировой клетчатки выполнялась в условиях операционных дерматологических отделений госпиталей Тенон, Энри Мондор, Сант-Луис или в условиях перевязочной дерматологического отделения НИИ медицинской микологии, методом инцизионной биопсии, или «punch-метод» биопсии - пункционной биопсии, с помощью специального трубчатого ножа (панчера) диаметром 4 мм. Забор материала производился с использованием местной анастезии 0,5% раствором лидокаина или ультракаина. Кожный дефект закрывался 2-3 швами, затем накладывалась давящая повязка с последующим снятием швов чрез 10 дней. Исследуемый материал помещался сначала на бумажную основу, а затем в стерильную тару с маркировкой, содержащей 10% нейтральный формалин, забуференный фосфатным буфером, с дальнейшей транспортировкой в лабораторию патоморфологии. Затем материал подвергался проводке. После гистологической проводки материал заливался в парафин для приготовления срезов толщиной 4 мкм.

Часть срезов монтировалась на высокоадгезивные стекла (Polysine) и высушивалась в течение 18 часов при температуре 37°С. Другая часть монтировалась на обычные стекла с последующей окраской гематоксилин-эозином. Гистологическое исследование проводилось в проходящем свете на световом микроскопе Carl Zeiss и Leitz Orhoplan (Германия) с использованием объективов 4х, 10х, 20х. Иммуногистохимическое исследование проводилось в ручном режиме с использованием набора реактивов DAKO Hercept Test. Оценка результатов проводилась с использованием светового микроскопа при увеличении объектива 10х и объектива 20х. Основные клеточные маркеры, используемые в работе при иммуногистохимическом исследовании представлены в таблице 2.

Таблица 2. Основные клеточные маркеры используемые при иммуногистохимическом исследовании

Nп\п Маркер Диагностическая значимость
1 CD3 отвечает за передачу внутриклеточного сигнала при активации Т-клеток
2 CD4 Т-лимфоциты (хелперы и индукторы).
3 CD7 наиболее ранний дифференцировочный антиген Т-клеток
4 CD8 супрессорные/ цитотоксические Т-клетоки
5 CD16 антиген NK-клеток и клеток миеломоноцитарного происхождения
6 CD19 экспрессируется большей частью В- лимфоцитов
7 CD20 В- лимфоциты, фолликулярные дендроциты. Не экспрессируется плазмацитами.
8 CD21 фолликулярные дендроциты при лимфоме из клеток маргинальной зоны
9 CD30(Ki-1) активированные В-, Т-, NK-клетки, моноциты, клетки Штернберга-Рида, опухолевые клетки АКЛК, лимфоматоидного папулеза
10 CD56 антиген естественных киллеров (NK-клеток).
11 Ki-67(MIB-1) маркер пролиферативной активности
12 Perforin протеин цитоплазматических гранул цитотоксических Т- лимфоцитов
13 GranzymeB активированные цитотоксические клетки (Т- и NK- клетки)
14 MUM1 В-лимфоциты герминогенных центров и плазматические клетки
15 ALK-1(р80) маркер CD30+ анапластической крупноклеточной лимфомы
16 CD138 маркер плазматических клеток
17 BCL-2 белок супрессор апоптоза
18 BCL-6 антиапоптотический белок, обнаруживается в центробластах и центроцитах
19 Kappa \Lamda определение характера пролиферации (опухолевая или реактивная)

Молекулярно- генетическое исследование. Молекулярно- генетическое исследование проводилось на базе молекулярно- генетической лаборатории госпиталя Сант-Луис института исследования кожи (Париж). Методом полимеразной цепной реакции определяли моноклональность популяции лимфоцитов путем исследования переаранжировки генов в локусе T- клеточного рецептора или в иммуноглобулиновом локусе.

Статистический анализ. Статистический анализ полученных данных производили с помощью программы «Statistica for Windows. V. 6.0». В исследовании использован непараметрический метод корреляционного анализа. В диссертации, количественные переменные в таблицах и тексте представлены в виде М (среднее) ± m (стандартная ошибка среднего). Суждение о связи между двумя показателями в одной выборке производилось на основании визуальной оценки графиков – гистограмм в модуле описательной статистики, а также с использованием специальных критериев (r s – коэффициент корреляции рангов Спирмена). Значимыми считались различия при величине p < 0,05.

При статистическом анализе сравнивались характеристики клинического, гистологических, иммуногистохимических и молекулярно-генетических исследований. Клинические характеристики для оценки статистического анализа определялись первичными и вторичными морфологическими элементами кожной сыпи. Гистологические изменения оценивались с помощью основных гистологических симптомов, таких как акантоз, кератоз, паракертаоз, экзоцитоз, эпидермотропизм, клеточная атипия (клетки с ядрами различной величины, формы, степени выраженности базофилии). При анализе показателей иммуногистохимического исследования проводилась оценка показателей кластеров дифференцировки клеточных рецепторов, антиапоптотических белков, маркеров митотической активности и цитотоксичности. Показатели молекулярно-генетических исследований для статистического анализа определялись наличием данных детекции перегруппировки генов в Т-клеточном рецепторе или тяжелых цепей иммуноглобулинов.

Результаты исследования и их обсуждение

В третьей главе изложены результаты собственных исследований. В первом разделе приведен анализ данных клинического исследования. Во втором разделе третьей главы описаны гистологические признаки инфильтрата 165 пациентов. В третьем и четвертом разделах отражены иммуногистохимические и молекулярно- генетические результаты исследований у пациентов с первичныи лимфоами кожи.

Завершающим разделом третьей главы является сопоставление полученных клинических, морфологических, иммуногистохимических и молекулярно-генетических методов диагностики первичных лимфом кожи.

Оценка диагностической значимости клинического метода исследования. Проведенные исследования показали, что наиболее информативным методом диагностики лимфом кожи на ранней стадии является клинический метод диагностики: при клиническом подходе кожи диагноз первичной лимфомы кожи был подтвержден у 165 пациентов (100%) (р< 0,001).

При сопоставлении отдельных клинических проявлений между собой были выявлены достоверные взаимосвязи. Так, цвет пятна коррелировал с наличием, а также с составом реакционного инфильтрата (R= 0,24; p< 0,006). У пациентов с острым процессом или в начальных стадиях заболевания цвет высыпаний характеризовался более яркой окраской, инфильтрат в подавляющем большинстве случаев имел признаки реактивного воспаления. Площадь бляшки и характер инфильтрата, а также его состав имели тоже прямую зависимость (R=0,25; p<0,003). Количество бляшек коррелировало с характером инфильтрата и его составом. У пациентов с папуло- некротическими высыпаниями размеры язвы находились в прямой зависимости от размера папул. Также размер папул коррелировал с составом инфильтрата (R= 0,93; p< 0,009). Количество папул коррелировало с наличием признаков опухолевой прогрессии, а размер узла - с размером язвы и корки (R= 0,93; p<0,003). Наличие признаков системности опухолевого процесса и висцеральные поражения имели прямую взаимосвязь с количеством узлов. (R = 0,17; p< 0,02 )

Также была определена взаимосвязь между размерами папулы, площадью пятна и наличием маркеров CD3, CD30. У больных с В-клеточными лимфомами обнаруживались корреляционные параллели между колличеством папулезных элементов и наличием маркеров CD16, наличием висцеральных поражений и маркерами CD8, перфорином и гранзимом В (маркерами цитотоксичности).

Обратную зависимость имели в большинстве случаев площадь бляшки и наличие признаков воспаления в инфильтрате, а также площадь пятна и признаки опухолевой прогрессии. Количество бляшек не имело кореляционной связи ни с цветом, ни с характером корок, а также не было взаимосвязано с признаками реакционного инфильтрата. Корреляция не определялась в соотношении размер узла и состав инфильтрата, количество узлов и цвет пятна, площадь бляшки.

Приведенная клиническая характеристика позволяет детализировать алгоритм постановки диагноза и предопределяет необходимость дополнения верификации диагноза морфологическим, иммуногистохимическим, молекулярно-генетическим методами исследований.

Оценка диагностической значимости морфологического метода исследования. При гистологическом обследовании больных ТКЛК диагноз был верифицирован у 73 пациентов (57%), а в группе больных ВКЛК у 25 человек (67%).

При иммуногистохимическом обследовании больных ТКЛК диагноз был верифицирован у 78 пациентов (61%), а в группе больных ВКЛК у 27 человек (74%).

При иммуногистохимическом исследовании в сочетании с морфологическим методом диагноз верифицирован у 88 больных ТКЛК и у 29 больных ВКЛК. У 5 пациентов были получены отрицательные результаты и у 43- сомнительные. (р< 0,01).

При сопоставлении отдельных гистологических изменений были выявлены достоверные взаимосвязи. Так, акантоз и кератоз коррелировали с наличием реакционного инфильтрата (R = 0,29; p< 0,00007). Кератоз, опухолевая прогрессия и характеристика инфильтрата имели также прямую зависимость (R= 0,31; p< 0,0003). Характеристика инфильтрата находилась в прямой зависимости от наличия таких симптомов, как кератоз, состав инфильтрата, наличие положительной экспрессии CD3, (R = 0,31; p< 0,0003). Состав инфильтрата имел обратную зависимость от наличия маркеров CD30, Ki67, JumB (R = -0, 42; p< 0,0009 ).

При сопоставлении иммуногистохимических изменений были выявлены достоверные взаимосвязи. Так, экспрессия маркеров JumB, Mib1 находилась в прямой зависимости от размеров папулы, размеров узла, площадью пятна, его цветом, формой, площадью и характером бляшки, мокнутием, размерами, характером, развитием узла. (R = 0,44; p< 0,000002). Обратную зависимость имели Ki67/Mib1 и площадь, цвет, форма пятна, характеристика бляшки, наличие мокнутия (R = -0,25; p< 0,003).

Оценка диагностической значимости молекулярно-генетического метода исследования. При обследовании пациентов с первичными Т-клеточными лимфомами кожи реаранжировка генов Т- кеточного рецепторе в инфильтрате определялась в группах: с грибовидным микозом и его вариантами у 69 из 79 пациентов; в других группах Т-клеточных лимфом кожи - у 33 из 49 пациентов.

В периферической крови наличие клона опухолевых клеток было выявлено у 18 пациентов с различными формами Т-клеточных лимфом кожи.

Определение цепей тяжелых иммуноглобулинов при В-клеточных лимфомах кожи оказалось положительным в 36 случаях из 37 обследованных пациентов.

При сопоставлении данных молекулярно-генетических исследований были выявлены достоверные взаимосвязи. Так, реарранжировка TCR имела обратную корреляционную взаимосвязь (R= -0, 19, p< 0,03) с площадью бляшки и ее характеристикой (R=0,03, р< 0,03).

Результаты сопоставления клинического, морфологического, иммуногистохимического и молекулярно-генетического методов диагностики первичных лимфом кожи. При клиническом обследовании больных диагноз лимфомы кожи был заподозрен у 165 пациентов.

При гистологическом исследовании у больных с различными формами лимфом кожи признаки опухолего инфильтрата определялись в 98 случаях. У 67 пациентов гистологические признаки не позволяли провести дифференциальный диагноз между опухолевым процессом и воспалительным дерматозом (рис. 1)

Рисунок 1. Частота выявления опухолевого инфильтрата у больных первичными лимфомами кожи гистологическим методом.

Микроабсцессы Потрие нам удалось обнаружить у 2 больных с бляшечной стадией и у 2 пациентов - с опухолевой стадией грибовидного микоза. Признаки эпидермотропной лимфомы наблюдалсь у 94 пациентов, а отсутствие признаков эпидермотропизма с наличием других признаков опухолевой прогрессии - у 19 пациентов.

При иммунофенотипировании инфильтрата удалось подтвердить диагноз различных форм лимфом кожи у 105 пациентов. При этом в группе из 67 пациентов с отсутствием гистологических признаков лимфомы кожи удалось верифицировать диагноз лимфомы кожи 6 пациентам. Однако, в некоторых случаях определялось отсутствие иммуногистохимических признаков при наличии признаков опухолевой прогрессии в гистологических препаратах. (рис.2)

Рисунок 2. Частота выявления опухолевого инфильтрата у больных первичными лимфомами кожи иммуногистохимическим методом.

Пан-Т-клеточные антигены (CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD43, CD44R, CD45RO) определялись в 78 случаях, из них в 51 - определялся фенотип Т-клеток памяти (CD3+, CD45RO+, CD4+, CD8-).(Рис. 3).

Признаки пан-В-клеточных антигенов (CD19, CD20, CD22, CD79а), а также признаки антиапоптотических белков bcl- 6 и bcl- 2, были обнаружены в инфильтрате у 27 больных.

Признаки абберантного фенотипа определялись у 23 пациентов.

Индекс пролиферативной активности был повышен в 38 случаях.

В совокупности гистологического и иммуногистохимического методов диагностики не удалось верифицировать диагноз у 48 пациентов

У больных грибовидным микозом в стадию неспецифических высыпаний диагноз был верифицирован в 8 случаях, в бляшечную стадию в 21 случае, а в опухолевую стадию в 6 случаях (рис. 3).

Рисунок 3. Частота выявления опухолевого инфильтрата у больных первичными лимфомами кожи гистологическим и иммуногистохимическим методом.

При исследовании методом ПЦР кожного инфильтрата у больных различными формами лимфом кожи реаранжировка генов Т- кеточного рецепторa в инфильтрате определялась в группах: с грибовидным микозом и его вариантами у 46 из 79 пациентов; в других группах Т-клеточных лимфом кожи - у 21 из 49 пациентов. У 26 больных с В-клеточными лимфомами кожи данное исследование определило признаки злокачественности лимфоцитов в инфильтрате с перестройкой генов, кодирующих тяжелые цепи иммуноглобулинов. В обеих группах в 65 случаях наблюдалось несоответствие результатов данного метода с данными клинического исследования.

У всех 5 пациентов с синдромом Сезари, а также у 2 пациентов с эритродермической формой грибовидного микоза была выявлена реаранжировка генов Т- клеточного рецептора в инфильтрате кожи (рис. 4)

Рисунок 4. Частота выявления опухолевого инфильтрата у больных первичными лимфомами кожи молекулярно-генетическим методом.

Таким образом, результаты сопоставления клинического, морфологического, иммуногистохимического и молекулярно-генетического методов диагностики первичных лимфом кожи показали, что при клиническом подходе первичных лимфом кожи диагноз лимфомы кожи был подтвержден у 165 пациентов (100%) (р< 0,001) (таблица 3).

Таблица 3. Сопоставление информативности различных методов исследования у больных первичными лимфомами кожи

Результаты исследований ТКЛК ВКЛК
+ - +/- Ds верифици рован + - +/- Ds верифици рован
клинический метод 128 0 0 100 37 0 0 100
гистологический метод 73 11 44 57 25 2 10 67
ИГХ метод 78 4 46 61 27 2 8 74
ИГХ+гистология 88 3 37 69 29 2 6 78
ПЦР 74 54 0 58 26 11 0 71

Примечание: (+) – лимфома кожи; (-) – лимфомы кожи нет; (+/-) нельзя исключить

При гистологическом обследовании больных ТКЛК диагноз был верифицирован у 73 пациентов (57%), а в группе больных ВКЛК у 25 человек (67%).

При иммуногистохимическом обследовании больных ТКЛК диагноз был верифицирован у 78 пациентов (61%), а в группе больных ВКЛК у 27 человек (74%).

При иммуногистохимическом обследовании в сочетании с морфологическим методом диагноз верифицирован у 88 больных ТКЛК и у 29 больных ВКЛК. У 5 пациентов были получены отрицательные результаты и у 43- сомнительные. (р< 0,01).

При использовании ПЦР диагноз был подтвержден у 74 пациентов с ТКЛК и у 26 больных ВКЛК. В 65 случаях в двух этих группах диагноз оказался отрицательным. (р< 0,01)

При статистической оценке информативности различных методов исследования в диагностике лимфом кожи с использованием непараметрических методов (критерий знаков) выявлена высокая степень достоверности всех использованных методов. Однако, анализируя абсолютные величины верифицированных диагнозов с использованием различных методов исследования, можно утверждать, что клинический метод является приоритетным.

Каждый из перечисленных клинических признаков не может являться патогномоничным для постановки диагноза, однако, совокупная интепретация клинических проявлений позволяет предположить возможный диагноз. Совокупный анализ клинических проявлений позволил в 165 случаях заподозрить диагноз первичной лимфомы кожи, который был в последующем подтвержден морфологическим, иммуногистохимическим и молекулярно- генетическим методами диагностики.

Роль метода иммуногистохимии в прогнозе течения заболевания у больных грибовидным микозом. Группу пациентов с классической формой грибовидного микоза, опухолевой стадией составили 8 человек. Пациенты этой

группы длительное время находились под наблюдением дерматолога. Данной стадии предшествовали стадия неспецифических высыпаний и бляшеная стадия. Опухоли формировались как в области уже существовавших бляшек, так и на видимо непораженной коже. Средняя продолжительность заболевания на период обращения составляла 2-4 года. Дебют заболевания приходился на возраст в 84,65% случаев. Опухолевая стадия грибовидного микоза наблюдалась в период от 65-79 лет.

Клиническая картина у данной группы пациентов была представлена папулами красного цвета, инфильтрированными бляшками красновато-бурого цвета круглой и овальной формы, размерами до 7 см в диаметре, а также опухолевидными образованиями, экзофитно возвышающимися над уровнем здоровой кожи, размером до 3-4 см в диаметре. Консистенция их была мягкая или тестоватая. Некоторые из опухолевых образований существовали длительно - 1-1,5 года, в отличие от других, которые, достигнув определенной величины, эрозировались и\или глубоко изъязвлялись. Опухоли имели тенденцию к экзофитному росту и по внешнему виду напоминали помидоры или шляпки грибов. У некоторых пациентов этой группы ногтевые пластинки кистей и стоп были утолщены, желтого цвета, неправильной формы. Признаки алопеции наблюдались у 3 пациентов.

Основные иммуногистохимические маркеры, экспрессирующиеся в клеточном инфильтрате больных грибовидным микозом, опухолевой стадией представлены в таблице 4.

Таблица 4. Выявление различных иммуногистохимических маркеров в

инфильтрате больных грибовидным микозом в опухолевую стадию

Положительная экспрессия иммуногистохимических маркеров n= 8
абс. %
CD2+ 4 50
CD3+ 4 50
CD4+ 4 50
CD5+ 6 75
CD7+ 8 100
CD45RO 2 25
CD8+ 6 75

В опухолевой стадии у большинства пациентов, как правило, сохранялись антигены CD2+, CD3+, CD4+, CD5+, CD45RO, однако у всех пациентов определялось отсутствие того или иного пан-Т-клеточного антигена (так называемые «иммунофенотипические дыры» или абберантный фенотип - коэкспрессия рецепторов Т- и В- лимфоцитов и/или Т- хелперов и Т- супрессоров, нулевые лимфоциты). У 6 пациентов определялась экспрессия CD8 маркера цитотоксичности, несвойственного у данной категроии больных. У 2 пациентов в эту стадию проявлялась экспрессия CD45RO, характеризующая активированные лимфоциты (клетки памяти). Также у всех пациенов в эту стадию заболевания определялось большое количество лимфоцитов, экспрессирующих белок Ki- 67, наличие в инфильтрате лимфоцитов с переустройством структуры Т- клеточного рецептора (TCR) или наличие тяжелых цепей иммуноглобулинов.

Наличие иммуноистохимических изменений сочеталось с ухудшением в течении кожного процесса и свидетельствовало о неблагоприятном прогнозе заболевания.

Таким образом, проведенные исследования показали, что иммуногистохимический метод диагностики может быть рекомендован для прогнозирования течения грибовидного микоза; о наличии опухолевой прогрессии и трансформации грибовидного микоза может свидетельствовать появление абберантного фенотипа Т- лимфоцитов.

Оценка влияния крупных анапластических клеток в инфильтрате больных грибовидным микозом на дальнейший прогноз заболевания. При обследовании группы пациентов с длительно существующим грибовидным микозом, у которых в дермальном инфильтрате появлялсь крупные анапластические клетки CD30+, не удалось выявить никаких специфических признаков, позволяющих провести дифференциальный диагноз между ассоциацией грибовидного микоза с CD30+ лимфопролиферациями и трансформацией грибовидного микоза. Очевидные различия у 8 пациентов с трансформацией ГМ, в которой было 2 пациента со значительным количеством крупных клеток CD30+ (>75% CD30+) и их небольшим количеством (75%) определялись лишь клиническими симптомами в виде ухудшения общего самочувствия, генерализации кожного процесса и резистентности к проводимой терапии. Такие же данные были опубликованы Loreau E. et all. в 2006 году. Морфологические признаки такие как: количество крупных анапластичных клеток, их группировка и скопления по 3-4 в инфильтрате не имели прогностического значения в исследуемой группе пациентов, в отличие от данных, опубликованных Diamandidou M, et al., 2003.

Таким образом, появление в инфильтрате крупных анапластических клеток не может считаться лишь признаком неблагоприятного прогноза заболевания, так как в 20 % случаев появление этих клеток наблюдается при ассоциации грибовидного микоза с CD30 лимфопролиферациями, это предопределяет отсутствие показаний к агрессивной патогенетичской терапии и требует лишь динамического наблюдения.

Выводы

1. Применение клинического метода исследования позволяет установить предварительный диагноз первичной лимфомы кожи в 100% случаев. К наиболее специфичным проявлениям относятся:

- для Т-клеточных лимфом кожи: высыпания в виде пятен, бляшек с «твердой текстурой» (88%); бляшек, разрешающихся с одной стороны и прогрессирующих с другой стороны, с образованием причудливых фигур (41%); локализация элементов в области туловища и конечностей (70%); субъективные ощущения, сопровождающие высыпания (79,1%); наличие атрофии и пигментации кожи (62,5%);

- для В-клеточных лимфом кожи: бляшки (35%); множественные папулы (32,5%); локализация высыпаний на туловище и волосистой части головы (51,5%);

- для CD30 лимфопролифераций: папулы с некрозом (91,5%).

2. Морфологический (гистологический и иммуногистохимический) метод исследования является наиболее информативным методом лабораторной диагностики первичных лимфом кожи и позволяет верифицировать диагноз у 69% больных первичными Т-клеточными лимфомами кожи и у 78% больных первичными В-клеточными лимфомами кожи.

3. Молекулярно- генетический метод исследования позволяет верифицировать дианоз у 58% больных первичными Т-клеточными лимфомами кожи (в том числе у 100% больных синдромом Сезари) и у 71% больных первичными В-клеточными лимфомами кожи.

4. Иммуногистохимический метод диагностики может быть рекомендован для прогнозирования течения грибовидного микоза; о наличии опухолевой прогрессии и трансформации грибовидного микоза может свидетельствовать появление абберантного фенотипа Т-лимфоцитов.

5. Появление в клеточном инфильтрате биоптатов кожи больных грибовидным микозом крупных анапластических клеток с положительной экспрессией CD30 не всегда свидетельствует о плохом прогнозе заболевания и может быть как признаком опухолевой трансформации грибовидного микоза, так и ассоциации грибовидного микоза с CD30 лимфопролиферациями.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

  1. Разнатовский К.И. Современная классификация лимфом кожи. Характеристики иммунного статуса лимфоидных клеток у больных с различными видами лимфом кожи / К.И. Разнатовский, А.Н. Родионов, С.В. Скрек // Клиническая дерматология и венерология.- 2008.-№2.- С.82-88.
  2. Разнатовский К.И. Увеличение частоты регистрируемых случаев заболеваемости Т-клеточными лимфомами кожи в Санкт-Петербурге и обласи за последние годы / К.И. Разнатовский, А.Н. Родионов, С.В. Скрек  // Сборник научных трудов. III российская научно-практическая конференция «Санкт-Петербургские Дерматологические чтения». -2009.- С. 36-37.
  3. Разнатовский К.И. Особенности организации референтного центра по оказанию помощи больным первичныи лимфомами кожи в условиях парижского стационара Сборник / К.И. Разнатовский, А.Н. Родионов, С.В. Скрек  // «Актуальные вопросы диагностики и терапии трудноизлечиваемых заболеваний кожи» СПб. 2007.-С. 208.
  4. Разна

     
Похожие работы:

«ЛУНЁВА Наталия Александровна СОЦИАЛЬНЫЙ СМЫСЛ И МЕДИЦИНСКИЙ ЭФФЕКТ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫХ ПРОГРАММ ДЛЯ ШКОЛЬНИКОВ 14.00.52 – социология медицины 14.00.21 - стоматология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук Санкт-Петербург - 2009 Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный университет Федерального агентства по образования РФ...»

«РЕМЕСЛО Марина Борисовна КЛИНИКО-ЛИНГВИСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ БОЛЬНЫХ НЕВРОЗАМИ И ИХ ДИНАМИКА В ПРОЦЕССЕ ПСИХОТЕРАПИИ Специальность: 14.00.18 — психиатрия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург 2007 Работа выполнена в ГУ Санкт-Петербургский научно-исследовательский психоневрологический институт им. В.М. Бехтерева Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Научный руководитель: кандидат медицинских...»

«КУЗНЕЦОВА Ирина Валерьевна Диагностика заболеваний тазобедренного сустава у лиц трудоспособного возраста на основе ультрасонографии и региональной допплерографии 14.01.13 – лучевая диагностика, лучевая терапия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук http://rncrr.ru Москва - 2011 Работа выполнена в ГОУ ДПО Уральская государственная медицинская академия дополнительного образования Росздрава (ректор – д.м.н., профессор Фокин А.А.). Научный...»

«Дёгтев Валерий Павлович ОТНОШЕНИЕ К ГОСПИТАЛИЗАЦИИ И ПРИСПОСОБИТЕЛЬНОЕ ПОВЕДЕНИЕ У БОЛЬНЫХ ПАРАНОИДНОЙ ШИЗОФРЕНИЕЙ Специальность 14.00.18 – психиатрия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург 2008 Работа выполнена в отделении внебольничной психиатрии Государственного учреждения Санкт-Петербургский научно- исследовательский психоневрологический институт им. В. М. Бехтерева Федерального агентства по здравоохранению и...»

«ЛАТЫПОВ Халил Ильдусович Клинико-лабораторная характеристика железодефицитной анемии у детей с гнойно-воспалительн ыми заболеваниями мягких тканей 14.01.21 – гематология и переливание крови АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Уфа - 2011 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Башкирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и...»

«Степанянц Николай Георгиевич КРИОХИРУРГИЧЕСКОЕ ЛЕЧЕНИЕ БАЗАЛЬНО-КЛЕТОЧНОГО РАКА КОЖИ С ПРИМЕНЕНИЕМ ВАЗАПРОСТАНА 14.01.17 – хирургия, 14.01.12 – онкология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2012 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова Министерства здравоохранения и...»

«Александрова Екатерина Сергеевна ЭФФЕКТИВНОСТЬ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТОВ КОРРЕКЦИИ ГЕМОДИНАМИКИ У ПАЦИЕНТОВ С НЕРЕКОНСТУИРУЕМЫМ ПОРАЖЕНИЕМ АРТЕРИЙ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ ПО ДАННЫМ УЛЬТРАЗВУКОГО ДУПЛЕКСНОГО СКАНИРОВАНИЯ 14.00.19 – Лучевая диагностика, лучевая терапия 14.00.44 – Сердечно- сосудистая хирургия...»

«НИКИТИНА Ольга Васильевна РОЛЬ АКТИВНОГО И ПАССИВНОГО ТАБАКОКУРЕНИЯ В ФОРМИРОВАНИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ 14.01.08 – педиатрия 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Оренбург – 2011г. Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Оренбургская государственная медицинская академия Министерства...»

«Шевченко Иван Иванович Ведение пациентов с острым коронарным синдромом на базе первичного сосудистого центра городской клинической больницы скорой медицинской помощи 14.01.0 5 – кардиология (медицинские науки) Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских...»

«УГЛАНОВ ЖАРКИНБЕК ШЕРТАЙУЛЫ Хирургическое лечение периапикальных деструктивных изменений зубов с использованием отечественного кальция гидроксилапатита АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинскихнаук 14.00.21 – Стоматология...»

«БУДКОВА ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ НЕОМЫЛЯЕМЫХ СОЕДИНЕНИЙ БОБОВ СОИ И АВОКАДО ПРИ ОСТЕОАРТРОЗЕ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УРОВНЯ АНТИТЕЛ К ОКИСЛЕННЫМ ЛИПОПРОТЕИНАМ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ 14.01.22 – ревматология А в т о р е ф е р а т диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград...»

«ПОЗДНЯКОВА НАТАЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА ЭФФЕКТИВНОСТЬ И ПЕРЕНОСИМОСТЬ СОЧЕТАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ ДИЛТИАЗЕМА И НИТРАТОВ С РАЗЛИЧНЫМИ ФАРМАКОДИНАМИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ У БОЛЬНЫХ СТАБИЛЬНОЙ СТЕНОКАРДИЕЙ И АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТОНИЕЙ 14.01.05 - Кардиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва - 2010 Работа выполнена в ФГУ Государственный научно-исследовательский Центр профилактической медицины Росмедтехнологии Научный руководитель: Доктор...»

«СВЕРДЛИН Дмитрий Сергеевич МЕДИЦИНСКИЕ ЭФФЕКТЫ И СОЦИАЛЬНЫЕ ОЦЕНКИ ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ДИСПАНСЕРИЗАЦИИ НАСЕЛЕНИЯ 14.00.52 - социология медицины АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград - 2009 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Волгоградский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ...»

«КАЛАШНИКОВА Юлия Сергеевна ОСОБЕННОСТИ ТЕЧЕНИЯ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТОНИИ У ПОЖИЛЫХ БОЛЬНЫХ С АФФЕКТИВНЫМИ РАССТРОЙСТВАМИ И ПРИ ИХ МЕДИКАМЕНТОЗНОЙ КОРРЕКЦИИ ПИПОФЕЗИНОМ 14.01.05 Кардиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград - 2013 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреж­дении высшего профессионального образования Волгоградский государ­ственный медицинский университет Министерства здравоохранения...»

«РЕВА Ирина Евгеньевна КОМПЛЕКСНОЕ МЕДИКО-СОЦИАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ СРЕДНЕГО МЕДИЦИНСКОГО ПЕРСОНАЛА СТОМАТОЛОГИЧЕСКОГО ПРОФИЛЯ 14.02.05 – социология медицины Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград – 2011 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и...»

«Ефремова Татьяна Гавриловна Социальная роль и профессиональный статус врача-офтальмолога 14.02.05 – Социология медицины Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград - 2010 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Волгоградский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ Научный руковод итель : доктор медицинских...»

«НЫСАНОВА БАХЫТ ЖАКЕНОВНА Обоснование к использованию съёмных конструкций с металлическим базисом в ортопедическом лечении дефектов зубных рядов 14.00.21 - стоматология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Республика Казахстан Алматы, 2010 Работа выполнена в Казахском национальном медицинском университете им. С.Д. Асфендиярова. Научный руководитель доктор медицинских наук, Алтынбеков К.Д. Официальные...»

«Петрова Мария Геннадьевна ИЗМЕНЕНИЕ КЛЕТОЧНОГО ЭНЕРГООБМЕНА И СОСТОЯНИЕ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ У ДЕТЕЙ С НИЗКОРОСЛОСТЬЮ. ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ 14.01.08 – педиатрия Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Волгоград – 2013 Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского Министерства...»

«Денисова Валентина Михайловна ЭПИДЕМИОЛОГИЯ, ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ БОЛЬНЫХ ЭРОЗИВНО-ЯЗВЕННЫМ БАЛАНОПОСТИТОМ, АССОЦИИРОВАННЫМ С БАКТЕРИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ 14.01.10 – кожные и венерические болезни АВТОРЕФЕРАТ Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук МОСКВА, 2011 г. Работа выполнена в отделе инфекций, передаваемых половым путем, Федерального государственного учреждения Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии Министерства...»

«Ашуев Жаруллах Абдуллахович Экспериментально – клиническое, функциональное и рентгенологическое обоснование ранней функциональной нагрузки при зубной имплантации 14.00.21 - Стоматология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва - 2008 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении...»








 
2014 www.avtoreferat.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.