WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

«ВИТВИЦКАЯ ЮЛИЯ ГЕННАДЬЕВНА НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ УРОГЕНИТАЛЬНЫЕ ИНФЕКЦИИ ЖЕНЩИН (этиология, клиника, диагностика, терапия) 14.00.11 – Кожные и венерические болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2009 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава Научный руководитель: доктор медицинских наук,...»

«ТИХОМИРОВА ИРИНА АНАТОЛЬЕВНА ХРОНИЧЕСКИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ ЛОР ОРГАНОВ В ФОРМИРОВАНИИ ПРОФИЛЯ ПАТОЛОГИИ РЕБЕНКА 14.00.09 – Педиатрия 14.00.04 – Болезни уха, горла и носа АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Санкт-Петербург 2009 Работа выполнена на кафедре госпитальной педиатрии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Федерального...»

«Крупянко Софья Михайловна ИННОВАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ КАК ФАКТОР ПОВЫШЕНИЯ КАЧЕСТВА ЛЕЧЕНИЯ ДЕТЕЙ С ВРОЖДЕННЫМИ ПОРОКАМИ СЕРДЦА 14.01.05 КАРДИОЛОГИЯ 14.02.03 ОБЩЕСТВЕННОЕ ЗДОРОВЬЕ И ЗДРАВООХРАНЕНИЕ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук Москва, 2010 Диссертационная работа выполнена в Научном Центре сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН. Научный консультант: Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Бокерия Лео Антонович...»


Pages:   || 2 |

Системный подход к банкированию пуповинной крови для восстановительной медиц и ны

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Яковлева Мария Валерьевна


системный подход к банкированию ПУПОВИННОЙ КРОВИ для восстановительной медицины

14.03.11

«Восстановительная медицина, лечебная физкультура и спортивная медицина, курортология и физиотерапия»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва 2010

Работа выполнена в Государственном Учреждении Здравоохранения города Москвы «Банке стволовых клеток Департамента города Москвы», ФГУ «Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники» Росздравнадзора РФ.

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор О.А.Машков

доктор медицинских наук, профессор М.Е. Рождественский

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А.А.Хадарцев

доктор медицинских наук, профессор Л.Б. Лазебник

доктор медицинских наук, профессор Ю.Г. Боженков

Ведущее учреждение: Институт детской гематологии и трансплантологии им. Р.М.Горбачевой Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. И.П.Павлова

Защита диссертации состоится «___» ___________ 201_ г. в ____ часов

на заседании диссертационного совета Д 208.001.02 при ФГУ «Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники» Росздравнадзора РФ. Адрес: 129301, г. Москва, ул. Касаткина, 3

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУ «Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники» Росздравнадзора РФ. Адрес: 129301, г. Москва, ул. Касаткина, 3

Автореферат разослан «_____» _____________ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Доктор медицицинских наук Цыганова Т.Н.

Общая характеристика РАБОТЫ

Актуальность работы

Введение.

Одной из самых актуальных проблем сoвpеменнoй мeдицины является охрана здоровья человека, для решения которой разработаны и утверждены соответствующие концепции и программы, целью кoторых является сохранение и восстановление здоровья. Разработка новейших корригирующих технологий, направленных на сохранение и восстановление функциональных резервов организма человека, восстановление его оптимальной работоспособности является основной стратегией современной восстановительной медицины (Разумов А.Н., Бобровницкий И.П. 2002,2003; Косорлукова Т.В., 2005). Для дальнейшего развития клеточного направления восстановительной медицины чрезвычайно актуален вопрос подготовки достаточного количества эффективного и безопасного клеточного материала для обеспечения трансплантаций и повышения регуляторных, компенсаторных и адаптивных возможностей организма.

После появления первых публикаций об успешном проведении трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в конце 80-х гг. XX века, начали свое развитие первые банки пуповиной крови (Gluckman E., 1989). Пуповинная кровь, представленная для использования некоммерческими государственными и коммерческими криобанками, в настоящее время является альтернативным источником гемопоэтических стволовых клеток, применяемых для трансплантации у детей и взрослых при ряде злокачественных заболеваний, синдромах недостаточности костного мозга, гемоглобинопатиях и некоторых генетических метаболических расстройствах (Gluckman E., 2006, 2010; Rocha V., 2006). Банкирование пуповинной крови – это совокупность процессов сбора, обработки, тестирований и криохранения биоматериала. За прошедшее десятилетие во всем мире увеличилась роль криохранения пуповинной крови и ее применения для трансплантации. Мировая ассоциация доноров костного мозга (World Marrow Donor Association - WMDA) собирает информацию о числе заготовленных единиц банками пуповинной крови по всему миру начиная с 1999 года. На 2008 год WMDA сообщает о деятельности 112 банков пуповинной крови, которыми заготовлено более 450 тыс. единиц пуповинной крови.

В настоящее время в Европе существует 18 банков пуповинной крови, которые получили аккредитацию в NetCord-FACT и еще 40 находятся на стадии регистрации (Navarrete C., 2009). Сегодня пуповинная кровь является признанной альтернативой костного мозга как источника гемопоэтических стволовых клеток, используемых для трансплантации в восстановительной медицине. На настоящий момент в мире выполнено более 10000 трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток с использованием пуповинной крови (Majhail N.S., 2006). По данным Gluckman T., Rocha V. начиная с 2006 года около 20% трансплантаций стволовых клеток, проводимых в Европе пациентам в возрасте до 20 лет, являются трансплантациями пуповинной крови ( http://worldmarrow.org/ ). Это говорит о том, что пуповинная кровь является ценным клеточным ресурсом для тех пациентов, которым не был найден совместимый донор костного мозга, особенно это важно для групп этнических меньшинств. Другим важным преимуществом пуповинной крови является более короткое время необходимое для поиска подходящего донорского материала в сочетании с дешевизной получения такого материала и его легкой доступностью, что особенно это важно для тех пациентов, которые нуждаются в проведении трансплантации в течение 3-х месяцев после проведения поиска донора. Вышеперечисленные преимущества являются предпосылкой для увеличения количества трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови. (Wagner J. E., 1992; Harris D. T., 1996; Kogler G., 1996; Ikuta К., 1998; Rubinstein P., 1999; Gluckman E., 2005, Querol S., 2009). Увеличение доступного пула единиц пуповинной крови улучшает вероятность обнаружения донорского материала с оптимальным абсолютным количеством ядросодержащих клеток на кг веса реципиента и минимальным количеством HLA-несовпадений.

Успех трансплантации во многом зависит от достаточного количества гемопоэтических стволовых клеток, поэтому важным вопросом применения пуповинной крови в клинической практике является оценка качества трансплантата, в основе которой лежит определение количества и жизнеспособности гемопоэтических стволовых клеток, содержащихся в трансплантационном материале (Bender J.G., 1994; Gonzalez B.E., 1997; Traineau R., 1998; Allan D.S., 2002; Cotta S.V. et al., 2002; Marino M.P. et al., 2002). Популяционные исследования полиморфизма генов главного комплекса гистосовместимости, проведенные у больных гемобластозами, свидетельствуют об ассоциативной связи системы HLA с острым лейкозом, как у взрослых, так и у детей. (Dorak M.T. 1992,1996,1999; Tayler G.M. 2002, 2008, 2009; Тананов А.Т. 1982; Хамаганова Е.Г.,1989; Зарецкая Ю.М., 2000, Рий А.А., 2007). Имеются данные, полученные отечественными авторами, которые показали повышение частоты встречаемости антигенов В17 и В40, а также снижение частоты встречаемости антигена DR7 у больных детей с острым лимфобластным лейкозом (Тимонова Л.А., Румянцев А.Г.1989). Практически отсутствуют современные данные изучения HLA системы при острых лейкозах у детей. Изучение и разработка высокотехнологичных методов банкирования пуповинной крови и определение стратегии HLA- типирования представляются актуальной задачей, так как позволяют расширить возможности для восстановления функциональных резервов организма у большого количества пациентов, к которым неприменимы стандартные протоколы диагностики и лечения.

Таким образом в связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования явилась разработка научно-организационного алгоритма и внедрение системного подхода к банкированию пуповинной крови с применением высокотехнологичных и молекулярно-генетических методик работы для трансплантаций в восстановительной медицине.

Задачи исследования:

  1. Разработать научно-обоснованный алгоритм банкирования пуповинной крови для трансплантаций в восстановительной медицине.
  2. Внедрить системный подход к банкированию пуповинной крови с использованием высокотехнологичных и молекулярно-генетических методик.
  3. Исследовать совокупность факторов, влияющих на состав и эффективность выделения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, анте- и интранатальных особенностей течения беременности, родов, антропометрических данных, пола новорожденного, срока гестации, различных состояний острой и хронической гипоксии плода.
  4. Проанализировать клеточный состав пуповинной крови, иммунологическую характеристику, уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов пуповинной крови, общее количество, жизнеспособность и эффективность клонирования гемопоэтических колониеобразующих единиц гемопоэтических стволовых клеток.
  5. Оценить влияние технологий обработки пуповинной крови на качество и эффективность выделения мононуклеарной фракции пуповинной крови.
  6. Оптимизировать алгоритм использования различных молекулярно-генетических методик HLA-типирования при банкировании пуповинной крови.
  7. Исследовать генетический полиморфизм антигенов гистосовместимости у здорового населения московского региона.
  8. Исследовать характер распределения специфических генов HLA-системы класса I и II при различных вариантах лейкозов у детей и выявить HLA-маркеры предрасположенности / устойчивости к ним.
  9. Разработать рекомендации системного подхода к банкированию пуповинной крови при неродственных трансплантациях и для восстановления функциональных резервов организма.

Научная новизна

Впервые на большом количестве материала пуповинной крови определена совокупность анте- и интранатальных факторов, оказывающих влияние на состав и эффективность выделения гемопоэтических стволовых клеток.

Впервые показано, что результаты автоматического гематологического анализатора и светооптической микроскопии независимы друг от друга и взаимно дополняют референтные значения клеточного состава пуповинной крови. Полученны данные уровня спонтанного апоптоза лейкоцитов в пуповинной крови, общего количества, жизнеспособности и эффективности клонирования гемопоэтических колониеобразующих единиц в конечном клеточном продукте, которые характеризуют эффективность материала для неродственной трансплантации и восстановления функциональных резервов организма.

Впервые в России оптимизированы процессы проведения исследований и оценки результатов HLA-типирования большого количества образцов пуповинной крови здоровых новорожденных и периферической крови при различных заболеваниях, представленные двумя молекулярными высокотехнологическими методами, такими как SSO на автоматическом процессоре и SSP, позволяющие получать достоверную и однозначную информацию.

Впервые на большом количестве материала изучен характер распределения HLA специфичностей класса I и II у здорового населения московского региона и установлен профиль генов HLA системы соответствующий европеоидам.

Впервые получены данные об особенностях распределения специфических аллелей генов HLA системы при лейкозах у детей и охарактеризованы дополнительные общие маркеры предрасположенности /устойчивости к их развитию.

Впервые разработан и внедрен научно-организационный алгоритм банкирования пуповинной крови, позволяющий обосновано применять высокотехнологичные методы сбора, оценки, тестирования, криохранения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови. Системный подход к банкированию позволил оптимизировать процесс стандартным условиям работы банков стволовых клеток и получать эффективный материал для неродственных трансплантаций, применение которого при различных заболеваниях повысит саморегуляторные, компенсаторные и адаптивные механизмы возможности организма.

Практическая значимость работы

Практическое значение работы заключается в том, что показана необходимость совместного использования методов автоматического подсчета клеток и светооптической микроскопии, взаимно дополняющих референтные значения клеточного состава пуповинной крови. Определение уровня спонтанного апоптоза лейкоцитов в пуповинной крови, общего количества, жизнеспособности и эффективности клонирования гемопоэтических колониеобразующих единиц в конечном клеточном продукте характеризует качество трансплантационного материала. Внедренный научно-организационный алгоритм позволяет обосновано применять оптимизированные высокотехнологичные методы банкирования пуповиной крови и получать эффективный клеточный материал для дальнейшего развития клеточного направления восстановительной медицины.

В результате выполненной работы предложена стратегия совместного использования методов HLA типирования большого количества образцов пуповинной крови (с применением технологий SSO и SSP), которая может быть применена в медицинских учреждениях аналогичного профиля в России. Охарактеризованный впервые профиль распределения генов главного комплекса гистосовместимости у здорового населения московского региона может быть использован в качестве группы сравнения в области изучения «HLA и болезни» и в популяционных исследованиях.

Основные положения, выносимые на защиту

Изучение совокупности анте- и интранатальных факторов, особенностей течения беременности, родов, антропометрических данные, пола новорожденного и срока гестации, различных состояний острой и хронической гипоксии плода позволяет оценить их влияние на состав и эффективность выделения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови для трансплантаций и восстановления функциональных резервов организма.

Эффективность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови характеризует количественный и качественный клеточный состав пуповинной крови, определенный с применением автоматического гематологического анализатора и светооптической микроскопии. Также эффективность конечного клеточного продукта пуповинной крови для трансплантаций и восстановления функциональных резервов организма характеризует уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов в пуповинной крови, общее количество, жизнеспособность, эффективность клонирования гемопоэтических колониеобразующих единиц.

Стратегия применения методов HLA-типирования образцов пуповинной крови, представленная двумя технологиями, такими как SSO и SSP, позволяет проводить быструю обработку большого количества биоматериала и получать достоверные и однозначные результаты.

Исследование полиморфизма генов HLA-системы позволило изучить характер распределения аллельных специфичностей среди здорового населения московской популяции.

Изучение иммуногенетических особенностей при лейкозах у детей позволяет обнаружить маркеры, определяющие риск или устойчивость к возникновению заболевания.

Комплекс усовершенствованных высокотехнологичных методов сбора, оценки, тестирования, хранения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, в том числе и типирования образцов по локусам HLA системы, является оптимальным, позволяющим получать однозначную и достоверную информацию и требующим для исследования минимального количества исследуемого биоматериала.

Внедренный научно-организационный алгоритм банкирования пуповинной крови, позволяет получать эффективный материал для повышения саморегуляторных, компенсаторных и адаптивных механизмов организма.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты исследования внедрены в работу Государственного учреждения здравоохранения города Москвы «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения города Москвы».

Работа выполнена на базе Государственного учреждения здравоохранения города Москвы «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения города Москвы», ФГУ «Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники» Росздравнадзора РФ, ЦПСиР ДЗ г. Москвы, родильном доме № 10 Управления здравоохранения ЮЗАО г. Москвы, родильном доме № 8 Управления здравоохранения ЮВАО г. Москвы, родильном доме № 17 Управления здравоохранения САО г. Москвы и городской больнице № 8 Управления здравоохранения САО г. Москвы.

Апробация диссертации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференциях и научных форумах республиканского и международного уровня, в том числе на Российском Съезде гематологов и трансфузиологов (Москва, 2006), Stem cell therapy meeting (Регенсбург, 2007), Всероссийском симпозиуме «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Москва, 2007), Российском медицинском форуме «Проблемы трансплантации пуповинной крови» (Москва, 2007), III Всероссийском симпозиуме «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Москва, 2007), 35 Международном симпозиуме Европейской группы EBMT (Гетеборг, 2010г.), V международном симпозиуме «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей» (Москва, 2009), XIV конгрессе педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2010г.), 5 иммуногенетической международной конференции «East-West Immunogenetics Conferece» (Пилсен, 2010г.), 36 Международном симпозиуме Европейской группы EBMT (Вена, 2010г.), III научно - практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ» (Москва, 2010), 24 Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместимости (European Immunogenetics and Histocompatibility Conference, EFI and 17 the Italian Society for Immunogenetics and Transplantation, AIBT) (Флоренция, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 49 научных работ в периодической печати, как в России, так и за рубежом, в том числе 10 статей в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 268 страницах печатного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключение, выводы и практические рекомендации, список литературы. Диссертация иллюстрирована 159 таблицами, 48 рисунками. Библиографический указатель содержит 35 источников отечественной и 312 источника зарубежной литературы.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

1. Образцы пуповинной крови (ПК) 3964 доношенных новорожденных полученные при физиологических и оперативных родах, прошедшие тестирование и внесенные в реестр неродственных доноров в г. Москве за период с 2003 по 2010 год. Сведения об общем объеме проведенных исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1. Объем проведенных исследований

Наименование показателей Количество
Общее количество образцов пуповинной крови 3964
Сведения о течении беременности 1564
Сведения о количестве предшествующих родов 3964
Масса плаценты 3299
Степень зрелости плаценты 2995
Сведения о течении родов 2995
Подсчет клеток крови 3964
Выделение клеточного концентрата 3964
Степень разведения образцов ПК 3964
Оценка количества субпопуляций лейкоцитов и ГСК 3964
Оценка колониеобразующей активности лейкоцитарной фракции ПК 3964
Определение уровня некроза и спонтанного апоптоза 3964
HLA-типирование 3964

Поскольку ряд показателей оценивались ретроспективно по данным медицинской документации, то не во всех случаях количество данных, включенных в расчет, совпадает с количеством образцов ПК.

После пережатия и пересечения пуповины производили пункцию сосудов пуповины специальной закрытой системой для забора пуповинной крови фирмы Green Cross объемом 250 мл, содержащей 35,5 мл антикоагулянта CPDA. Сбор крови осуществляли в течение 2–15 минут после родов (менее 5 минут – 3345 случаев (84,4%), от 5 до 10 минут – 345 случаев (8,7%) и более 10 минут – 274 (6,9%)), до отделения плаценты (n=3904 (98,5%)). В случае сбора крови после отделения плаценты (n=50 (1,5%)), плацента помещалась в специальную стерильную стойку и проводилась аналогичная процедура сбора ПК. Полученный материал хранили в темном месте при комнатной температуре и подвергали анализу не позднее 36 часов после процедуры сбора ПК.

Особенности течения беременности проанализированы у 1564 роженицы. Из 1564 обследованных рожениц - полностью здоровы – 248. Из 3964 новорожденных 2261 родились в результате первых родов, 1136 – вторых, 350 – третьих и 100 – роды четвертые и более (90 человек – 4-е роды, 14 человека – 5-е и 13 человека – 6-е). Процент мальчиков и девочек среди групп, составленных по порядковому номеру родов, не отличался. В каждой из групп девочек и мальчиков было приблизительно поровну. Вес плаценты проанализирован в 3299 случаях. Средний вес плаценты в группе составил – 580,57±4,92, диапазон: 77,0 г – 1138,0 г. Течение и осложнение родов прослежены у 1331 новорожденного. Все новорожденные были разделены на группы согласно способу родоразрешения: самостоятельные роды и роды путем кесарева сечения. Медиана длительности безводного промежутка составила 5 часов (от 20 минут до 19 часов 20 минут). Медиана длительности II периода родов (от начала потуг до рождения ребенка) составила 30 минут (от 10 минут до 1 часа 35 минут). Из 3964 образцов, для которых доступны данные относительно пола ребенка, мальчиков и девочек было 2069 (52,2%) и 1895 (47,8%), соответственно. Средняя масса при рождении была несколько выше у мальчиков (3629,24±18,25 г.; диапазон: 2270-5000 г.), чем у девочек (3467,23±18,17 г.; диапазон: 2300-4650 г.) (р<0,0001). Из 1564 новорожденных у 232 отмечалось изменение цвета околоплодных вод (224 – зеленые воды и 8 – кровянистые), что является косвенным признаком внутриутробной гипоксии плода, у 180 – во время беременности была диагностирована внутриутробная гипоксия плода, у 361 –отмечалось обвитие пуповины при рождении, у 109 – отмечалось внутриутробная задержка развития плода. Медиана гестационного возраста в группе без внутриутробной задержки развития составила 40 недель (диапазон – 33-42), а в группе с задержкой развития – 38 недель (диапазон – 37-41). Все новорожденные, у которых имеются сведения о степени зрелости плаценты на момент родов, были разделены на три группы по степени зрелости плаценты.

Выделение клеточного концентрата, содержащего стволовые клетки, проводилось в асептических условиях, в «чистом» помещении класса D двумя методами: методом двойного центрифугирования и аппаратным методом с помощью аппарата «Sepax S100», Biosafe, Switzerland (1986 и 1978 образца, соответственно). Все обработанные образцы были подвергнуты криоконсервации в роботизированном криокомплексе “BioArchive®”, ThermoGenesis, USA. Непосредственно перед криоконсервацией, в каждый образец добавлялся криопротектор DMSO в смеси с декстраном-40 в количестве 20% от объема конечного продукта для предотвращения разрушения клеток концентрата ПК под воздействием сверхнизких температур.

Степень разведения образцов ПК антикоагулянтом была различна и зависела от объема собранной крови. Объем антикоагулянта в системе постоянный и составляет 35,5 мл, объем собранной крови колебался в пределах от 20,0 до 170,0 мл. Пересчет результатов автоматического анализа крови проводился с учетом степени разведения каждого образца для каждого показателя.

Подсчет клеток ПК производился двумя методами:

  • все 3964 образцов ПК были подвергнуты анализу автоматическим счетчиком клеток крови ABX Pentra 60 C+ в режиме автоматической аспирации с определением 26 параметров;
  • для точной морфологической характеристики клеток ПК использовали мазки, окрашенные по методу Паппенгейма-Крюкова (комбинированная окраска фиксатором-красителем Мая-Грюнвальда и краской Романовского).

Количество нормобластов определяли при подсчете лейкоцитарной формулы на 200 последовательно встречающихся лейкоцитов с дальнейшим пересчетом на 100 (нормобласты/100лейкоцитов).

Количество субпопуляций лейкоцитов и гемопоэтических стволовых клеток определялось по экспрессии мембранных маркеров (CD – clusters of differentiation) в реакции прямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами CD3, CD4, CD8, CD13, CD14, CD16, CD19, CD25, CD30, CD31, CD33, CD34, CD38, CD44, CD45, CD56, CD61, CD62L, CD62E, CD71, CD90, CD106, CD117, CD133, HLA-DR «Becton Dickinson», США при помощи проточной цитометрии на приборе FACSCalibur «Becton Dickinson», США.

Колониеобразующую активность лейкоцитарной фракции ПК определялась двумя методами:

1. культивирование в течение 14 суток в метилцеллюлозе (готовая среда, содержащая факторы роста «MethoCult 4338, StemCellTehnologies, Canada) с подсчетом количества КОЕ-mix, КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-Э.

  • Эффективность клонирования (ЭК) определяли как общее число КОЕ на 1 х 105 эксплантированных клеток
  • Для определения абсолютного количества гемопоэтических предшественников в 1 мл ПК, полученные величины эффективности клонирования умножали на число мононуклеарных клеток в 1 мл крови.

2. Культивирование в полутвердой среде в системе «агаровая капля – жидкая среда» в течение 7 суток с расчетом следующих показателей:

  • колониеобразующая (КОС) и кластерообразующая (КлОС) способность – число колоний (малые-20-40 клеток, средние- 41-100 клеток и большие – более 100 клеток) и кластеров (малые – 5-9 клеток, большие – 10-19 клеток) на 1 х 105 эксплантированных клеток.
  • эффективность клонирования (ЭК) – общее число колоний и кластеров на 1 х 105 эксплантированных клеток
  • для определения абсолютного количества гемопоэтических предшественников в 1 мл крови, полученные величины эффективности клонирования умножали на число мононуклеарных клеток в 1 мл крови.
  • пролиферативный потенциал (ПП) – отношение числа колоний к кластерам в культуре.

Уровень некроза и спонтанного апоптоза лейкоцитов, гранулоцитов и лимфоцитов ПК. Исследование проводилось при помощи проточной цитофлюориметрии двумя методами: определение количества клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК при окрашивании Propidium iodid (PI) и определение числа локусов связывания мембранного фосфатидил-серина в реакции прямой иммунофлюоресценции с использованием Annexin V FITC ("Phar Mingen"), согласно инструкциям производителей. Результаты реакции анализировали на проточном цитофлюориметре FACScan ("Becton Dickinson”, США). Обработку полученных данных производили при помощи программы WinMDI 2.8 for Windows. Уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов, гранулоцитов и лимфоцитов клеток ПК определяли как сумму PI+/Annexin V+ и PI-/Annexin V+ клеток, а уровень некроза, как количество PI+/Annexin V- клеток.

Исследование генетического полиморфизма HLA системы ПК. Были исследованы 2650 образцов пуповинной крови условно здоровых детей. Геномная ДНК выделялась из образцов ПК методом сепарации на магнитных частицах, который основан на способности магнитных частиц адсорбировать на своей поверхности высвобожденную из клеток ДНК с помощью специфических лиганд. Характеристики выделенной ДНК, её концентрацию и степень чистоты, измеряли с помощью спектрофотометра. Концентрация ДНК измерялась против чистого элюирующего раствора по оптической плотности OD260/280 Образцы для исследования соответствовали предъявляемым стандартным требованиям: концентрация ДНК была > 50 нг/мкл, и А260/280 составляло 1,7-1,9. Генотипирование проводилось методом гибридизации с помощью олигонуклеотидных зондов. Считывание и интерпретация результатов проводилась с помощью сканирующего устройства и компьютерной программы PMP. Данным методом выявлялись HLA-специфичности по всем исследуемым локусам на уровне групп аллелей. Образцы, у которых были получены двойные интерпретации результатов, дополнительно типировались методом ПЦР с помощью аллель-специфических праймеров. Регистрация сигналов электрофореграммы, фотографирование изображения и документирование их в электронном виде осуществлялось с помощью гельдокументирующей системы «ДиДжиДок» (США) и с использованием компьютерной программы UPV. Интерпретация результатов проводилась с помощью таблиц.

2.Образцы периферической крови 187 детей с диагнозом ОЛЛ и 146 детей с диагнозом ОМЛ (112 мальчиков и 75 девочек, в возрасте от 6 мес. до 17 лет, средний возраст составил 8,3 лет ± 4,6) и 146 детей, больных ОМЛ (88 мальчиков и 58 девочек, в возрасте от 6 мес. до 17 лет, средний возраст составил 8,9 лет ± 5,2). Все пациенты имели неблагоприятный прогноз и нуждались в дальнейшей трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

В зависимости от иммунологического варианта дети, больные ОЛЛ, были разделены на три группы: 1 группа В-ОЛЛ (98 пациентов); 2 группа Т-ОЛЛ (37 пациентов); 3-ю группу составляли дети, с не установленным иммунологическим вариантом (52 пациента). Дети, больные ОМЛ, были разделены в зависимости от цитоморфологической характеристики заболевания в соответствии с FAB классификацией на группы: М2 - 28 больных, М4 – 26 больных, М5 - 28 больных и М7 - 18 больных. Группы больных вариантами ОМЛ М0 (5 детей), ОМЛ М1 (5 детей) и М6 (4 ребенка), были малочисленными и потому не были включены в исследование. Помимо этого, была выделена группа с не установленным морфологическим вариантом (32 ребенка).

Статистическая обработка результатов.

Статистическую обработку данных производили для вариационных рядов с параметрическим распределением с помощью однофакторного дисперсионного анализа и оценкой по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони и тесту Ньюмена-Кейлса; для вариационных рядов с непараметрическим распределением с помощью критерия Крускалла-Уоллеса и критерия Манна-Уитни. Для оценки равенства долей использовали Z-тест. Корреляционный анализ проводили с использованием уравнений линейной регрессии и по методу Спирмена для рядов с непараметрическим распределением. Для оценки полученных результатов и степени достоверности ассоциативных связей между генами системы HLA и изучаемыми заболеваниями в работе были использованы показатели: частота встречаемости гена (f), критерий Z c поправкой Йейтса на непрерывность, точный двусторонний критерий Фишера, если один из параметров был меньше 5, уровень достоверности (р). В случае, когда нулевая гипотеза отвергалась с вероятностью ошибки меньше, чем 5%, рассчитывался относительный риск RR и отношение шансов OR с доверительными интервалами 95% CI, если один из показателей был равен 0, относительный риск вычислялся по модифицированной формуле Haldane для малых чисел. В случаях, когда RR>2 (OR>2) вычислялась этиологическая/превентивная фракция. Статистический анализ исследования ассоциаций проводился с использованием двупольной таблицы при помощи программы «Open Epi» (Open Source Epidemiologic Statistics for Public Health), версия 2.3 (2009/20/05). Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики пакета Excel Microsoft и программы «Biostat», «SISA» и «EpiMax Table Calculator». При расчетах использовали программы Excel 2002 Pro, STATISTIKA for Windows 8.0, Biostat for Windows.

Результаты исследования

В развитии клеточного направления восстановительной медицины чрезвычайно актуален вопрос подготовки достаточного количества эффективного и безопасного клеточного материала, применение которого при различных заболеваниях повысит регуляторные, компенсаторные и адаптивные механизмы возможности организма.

Особенности клеточного состава ПК новорожденных

Результаты исследования количества клеток и их основных параметров при помощи автоматического гематологического счетчика были проанализированы и представлены в таблице 2.

Таблица 2. Референтные значения клеточного состава ПК

Лейкоцитарная формула (M+m), n=3964
WBC/(109 17,24 + 0,16
NEU/(109 8,41 + 0,10
LYM/(109 5,54 + 0,06
MON/(109 2,42 + 0,03
EOS/(109 0,64 + 0,01
BAS/(109 0,23 + 0,01
RBC /(1012/л) 4,40 + 0,01
HGB/(г/л) 157,4 + 0,46
HCT (%) 32,29 + 0,14
MCV/(фл) 105,81 + 0,12
MCH/(пг) 35,83 + 0,04
MCHС/(пг) 338,6 + 0,24
RDW (%) 12.71 + 0,02
MCH/(пг) 35,83 + 0,04
PLT / /(109 307,54 + 1,97
MPV / (фл) 7,18 + 0,02

Скрининг состава и характеристик клеток пуповинной крови, проводимый при помощи автоматических счетчиков клеток крови в работе банков ПК не вполне удовлетворителен, поскольку ПК имеет некоторые физиологические отличия от периферической крови взрослого человека, а большинство автоматических анализаторов крови откалиброваны под нормативы крови взрослого человека. Современные гематологические анализаторы являются специализированными автоматизированными приборами с компьютерной обработкой сигналов с неоспоримыми преимуществами (высокая производительность, возможность практически полной автоматизации, высокая информативность и точность) по сравнению с ручными методами. ПК характеризуется тем, что наряду со зрелыми элементами нейтрофильного ряда, содержит повышенное количество палочкоядерных нейтрофилов и более молодые формы - метамиелоциты и миелоциты.

При исследовании ПК окрашенные мазки оценивались с помощью световой микроскопии. Полученные результаты (средние величины по группе) затем сравнивались с величинами, полученными при исследовании тех же образцов пуповинной крови при помощи автоматического анализатора клеток крови. Отмечено, что при автоматическом анализе занижается процентное соотношение нейтрофилов, а лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов увеличивается. Все изменения были статистически достоверны (табл.3.).

Таблица 3. Различия клеточного состава ПК при подсчете клеток при помощи автоматического анализатора и светооптической микроскопии, в %

Лейкоцитарная формула Автоматический анализ (M+m), n=3964 Ручной подсчет (M+m), n=3964
NEU 47,48+ 0,44 57,48+ 0,47
LYM 32,76+ 0,36 28,66+ 0,43
MON 14,64 0,124 9,95+ 0,19
EOS 3,86+ 0,10 3,28+ 0,13
BAS 3,41+ 0,04 0,61+ 0,03

Прмечание. p<0,0001-степень достоверности отличий

Показано, что при большом содержании в ПК лейкоцитов увеличивается степень различий в определении в ПК базофилов (r=-0,44, p<0,0001), лимфоцитов (r=-0,25, p<0,0001), нейтрофилов (r=-0,22, p<0,0005). При большом содержании в ПК нормобластов увеличивается степень различий в определении в ПК базофилов (r=-0,36, p<0,0001), лимфоцитов (r=-0,4, p<0,0001), нейтрофилов (r=-0,27, p<0,0001). Полученные закономерности не зависели от сроков гестации, степени разведения образца ПК антикоагулянтом, времени, прошедшего после родов до начала сбора и обработки ПК.

Иммунологическая характеристика клеточного состава ПК (количество CD34+ клеток в ПК) определялась с помощью проточной цитометрии и оценивалась как 2 параметра: процент от общего количества лейкоцитов - 0,827+ 0,023 и абсолютное количество CD клеток - 0,100+0,003 в 1мл ПК.

Оценивалось количество CD34+CD133+ клеток, как наиболее ранних предшественников гемопоэза, количество CD133+ клеток и их субпопуляций CD133+CD31+ - эндотелиальные предшественники, CD133+CD106+ - мезенхимальные стволовые клетки, количество пролиферирующих гемопоэтических предшественников по уровню экспрессии трансферринового рецептора (CD71) в ПК и концентрате - достоверных различий не было выявлено, что говорит о качестве полученного концетрата стволовых клеток.

Количество колоний оценивалось на 105 MNC и на 1 мл ПК. Также подсчитывался процент колоний каждого вида от их общего количества., было выявлено преобладание ранних ГСК- КОЕ-ГЕММ-35,3 % (рисунок 1.).

Рисунок 1. Распределение колониеобразующих единиц пуповинной крови.

Была выявлена статистически значимая положительная корреляционная взаимосвязь как между процентом CD34+ клеток в ПК и количеством КОЕ-mix в 1 мл образца (r=0,231; р=0,013), так же и абсолютным количеством CD34+ клеток в ПК и КОЕ-mix в 1 мл образца (r=0,3888; р=0,001), КОЕ-ГМ (r=0,4285; р=0,001), КОЕ-Г (r=0,2887; р=0,0018), КОЕ-М (r=0,3197; р=0,0005) и общим количеством КОЕ в мл образца (r=0,4187; р=0,001). Прямых корреляционных взаимосвязей между сроком гестации и количеством КОЕ не было выявлено.

Уровень некроза лейкоцитов ПК составил 3,49 ± 0,28 %, при этом, уровень некроза лимфоцитов был ниже значений всех лейкоцитов (2,99 ± 0,34 %) и статистически значимо отличался от уровня некроза моноцитов и гранулоцитов, составлявшего 5,59 ± 0,72 % и 6,12 ± 0,65 % соответственно (р < 0,0001) (рис. 2.).

Рисунок 2. Уровень некроза и спонтанного апоптоза лейкоцитов ПК

Уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов составил 9,18 ± 1,19 %, при этом, уровень спонтанного апоптоза лимфоцитов, был также ниже значений в общей группе (4,32 ± 0,7 %), и также статистически значимо отличался от уровня спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов, составившего 15,35 ± 2,02 % и 28,22 ± 2,51 % соответственно (р < 0,0001).

Такое соотношение показателей позволяет предположить большую жизнеспособность лимфоцитов, что представляется позитивным результатом, учитывая тот факт, что популяция ГСК находится в пуле лимфоцитов. Это предположение подтверждается положительной корреляционной взаимосвязью количества лимфоцитов и колониеобразующей активностью ПК (табл. 4.).

Таблица 4. Взаимосвязь количества лимфоцитов и колониеобразующей активности ПК

Лимфоциты
r р
KOE-mix 0,399 < 0,001
КОЕ-ГМ 0,4993 < 0,001
КОЕ-Г 0,4467 < 0,001
КОЕ-М 0,4995 < 0,001
КОЕ-Эр 0,2068 0,0018
КОЕ-сумма 0,5634 < 0,001

При изучении взаимосвязи уровня спонтанного апоптоза лимфоцитов и колониеобразующей активности клеток пуповинной крови и оказалось, что отмечается положительная корреляционная взаимосвязь между уровнем спонтанного апоптоза лимфоцитов и колониеобразующей активностью пуповинной крови, что доказывает однонаправленность процессов апоптоза и пролиферации (табл. 5.).

Таблица 5. Взаимосвязь уровня апоптоза лимфоцитов и колониеобразующей активности ПК

Доля лимфоцитов на разных стадиях апоптоза
r p
KOE-mix 0,4427 0,0208
КОЕ-ГМ 0,2948 0,1525
КОЕ-Г 0,3537 0,0828
КОЕ-М 0,3003 0,1447
КОЕ-Эр -0,1221 0,544
КОЕ-сумма 0,3677 0,0706

При исследовании клеточного состава ПК в зависимости от пола было выявлено, что у девочек уровень лейкоцитов выше (17,74±0,24 х109/л; М±m), чем у мальчиков (16,8±0,23 х109/л; р=0,005), преимущественно за счет нейтрофилов, которых у девочек больше, а лимфоцитов, моноцитов и эозинофилов меньше. В абсолютных количествах у девочек также больше нейтрофилов, а меньше эозинофилов (табл. 6.).

Таблица 6. Процентное соотношение клеток в лейкоцитарной формуле в зависимости от пола новорожденного( M+m)

Пол WBC (109/л) Лейкоцитарная формула (%)
NEU LYM MON EOS BAS
Девочки n 1920 1920 1920 1920 1920 1920
M+m 17,74+ 0,24 49,97+ 0,35 31,57+ 0,15 13,75 3,48+ 0,07 1,26+ 0,03
Мальчики n 2044 2044 2044 2044 2044 2044
M+m 16,80+ 0.23 47,10+ 0.34 33,23+ 0.30 14,29+ 0.17 4,16+ 0.09 1,18+ 0.03
р 0,005 < 0,001 < 0,001 0,018 < 0,001 0,06
Пол WBC (109/л) Лейкоцитарная формула(109/л)
NEU LYM MON EOS BAS
Девочки n 1920 1920 1920 1920 1920 1920
M+m 17,74+ 0,24 8,93+ 0.14 5,5+ 0.093 2,44+ 0.04 0,60+ 0.01 0,24+ 0.01
Мальчики n 2044 2044 2044 2044 2044 2044
M+m 16,80+ 0.23 7,94+ 0.12 5,54+ 0.09 2,40+ 0.05 0,68+ 0.02 0,22+ 0.02
р < 0,001 0,938 0,537 < 0,001 0,158 < 0,001

Количество эритроцитов (4,33±0,02 х1012/л) и содержание гемоглобина (155,1±0,7 г/л) у девочек меньше, чем у мальчиков (4,46±0,02 х1012/л; 159,5±0,6 г/л; р<0,0001). Гематокрит у девочек (31,79±0,2 %) также меньше, чем у мальчиков (32,76±0,19 %; р=0). Различий в эритроцитарных индексах (MСV, MCH, MCHC, RDW) в зависимости от пола новорожденного не обнаружено. Количество тромбоцитов у девочек (314,87±2,98 х109/л) больше, чем у мальчиков (300,72±2,62 х109/л; р<0,0001). Средний размер тромбоцитов не имеет различий.

Было выявлено, что у мальчиков CD34+ клеток больше в процентном (0,88±0,03 – мальчики; 0,77±0,03 – девочки; р=0,01) и в абсолютном количестве (0,106±0,005 – мальчики; 0,095±0,005 – девочки; р=0,002) (табл. 7.).

Таблица 7. Количество CD34+ клеток в пуповинной крови доношенных новорожденных мальчиков и девочек

Пол ребенка Параметры CD34 (%) CD34 (10/mm)
Девочки Мальчики n 1920 1920
M+m 0,769+0,032 0,095 +0,005
n 2044 2044
M+m 0,883 +0,032 0,106+ 0,005
р 0,01 0,002

При анализе данных колониеобразующей активности ПК выявлено, что у мальчиков статистически значимо большее количество КОЕ-ГМ в 1 мл ПК (745,71±65,11 – девочки; 1216,7±185,45 – мальчики; р=0,022), и имеется тенденция к увеличению (статистически незначимо) количества КОЕ-М (691,64±78,6 – девочки; 1052,1±252,09 – мальчики; р=0,19) и общего количества колоний (4883,13±455 – девочки; 6070,8±691 – мальчики; р=0,16) в 1 мл образца ПК. При анализе эффективности клонирования (на 105 MNC) у мальчиков также больше КОЕ-Г (18,44±1,31 – девочки; 22,42±1,6 – мальчики; р=0,058). В процентном соотношении имеется тенденция к увеличению количества КОЕ-mix (р=0,11) у девочек, и уменьшению у них КОЕ-ГМ (р=0,13) и КОЕ-Эр (р=0,14).

Связь клеточного состава с массой тела новорожденного очень слабая: достоверная положительная корреляция с массой тела ребенка обнаружена для нейтрофилов (r=0,12; р=0,0002), эозинофилов (r=0,14; р=0,0001), базофилов (r=0,12; р=0,0002) и гематокрита (r=0,2; р<0,0001). Все новорожденные были разделены на группы согласно массе тела при рождении: 2500 г; 2500-3000 г; 3000-4000 г и >4000 г. При сравнении полученных данных отмечено, что с увеличением массы тела ребенка при рождении увеличивается количество лейкоцитов – от 15,52±0,59 х109/л в группе с массой тела 2,5-3 кг до 17,51±0,44 х109/л в группе с массой тела >4 кг (р=0,01). Также увеличивается абсолютное количество нейтрофилов и эозинофилов (р<0,0001 и р=0,004, соответственно), а количество моноцитов уменьшается (р<0,0001). В процентном соотношении у детей с большей массой тела нейтрофилов и эозинофилов больше, а лимфоцитов и моноцитов меньше. Концентрация гемоглобина и количество эритроцитов не менялись в зависимости от массы тела ребенка при рождении. Отмечено увеличение гематокрита с увеличением массы тела ребенка (от 28,48±2,47% при массе тела 2,5 кг до 33,86±0,39 % при массе тела >4 кг; р<0,0001). Отмечено также уменьшение MCHC (р<0,0001) и увеличение MPV (р=0,025) с увеличением веса ребенка. При проведении регрессионного анализа достоверных корреляционных взаимосвязей количества CD34+клеток и колониеобразующей активностью ПК и массы ребенка при рождении не получено. Наиболее статистически значимо увеличение среди KOE-mix (р=0,096).

Влияние технологического процесса на биологические свойства ПК

Известно несколько методов редукции объема ПК, но очевидны и некоторые их недостатки, например, длительный процесс центрифугирования, неудобный для производственного потока банков пуповинной крови и недостаточная надежность, сильно связанная с опытом и квалификацией оператора. Был разработан и внедрен в эксплуатацию принципиально новый клеточный сепаратор, адаптированный к клеточным суспензиям малого объема (Sepax, Biosafe S.A., Eysins/Nyon, Швейцария). Эта система состоит из компьютеризированной автоматизированной процедуры цитафереза, гарантирующей очень эффективную редукцию объема и маленькое количество эритроцитов в конечном продукте в функционально замкнутой системе. Конечный продукт собирается прямо в мешки для замораживания и может быть заморожен немедленно после добавления диметилсульфоксида (ДМСО). Однако, ряд факторов, влияющих на клеточный состав и характеристики клеток пуповинной крови, может выходить за стандартные рамки программирования процесса сепарации требовать использования метода двойного центрифугирования. Для этого сравнили эффективность метода автоматического выделения клеточного концентрата ПК при помощи технологии Sepax и метода двойного центрифугирования оператором с использованием гидрооксиэтилированного крахмала (HES) в условиях ситуаций, влияющих на клеточный состав ПК, равных для каждого из методов.

Проводимая для уменьшения объема ПК крови процедура лейкоконцентрации, основанная на седиментации эритроцитов раствором гидроксиэтилкрахмала, влияет на соотношение количества клеток ПК, так как, вероятно, степень потери различных субпопуляций лейкоцитов отличается. Полученные данные представлены в таблице 8.

Таблица 8. Клеточный состав ПК и концентрата (х 109/л)

Виды клеток Параметры WBC NEU LYM MON EOS BAS
Клеточный состав ПК (х 109/л)
n 3964 3964 3964 3964 3964 3964
M+m 17,24+ 0,48 8,41+ 0,10 5,54+ 0,06 2,42+ 0,03 0,64+ 0,01 0,23+ 0,01
Клеточный состав концентрата ПК (х 109/л)
n 3964 3964 3964 3964 3964 3964
M+m 39,00+ 0,48 18,30+ 0,27 13,10+ 0,19 5,20+ 0,08 1,10+ 0,01 0,20+ 0,01

Показано, что при проведении процедуры концентрации ПК, основанной на процессе седиментации эритроцитов под действием гидроксиэтилкрахмала, доля нейтрофилов не изменяется, доля лимфоцитов статистически значимо повышается (рис.3) за счет того, что доля моноцитов, эозинофилов и базофилов статистически значимо снижается (рис.4). Это, по-видимому, связано с большей потерей этих клеток при концентрации.

Рисунок 3. Доля нейтрофилов и лимфоцитов в пуповинной крови и концентрате мононуклеарной фракции ПК.

Рисунок 4. Доля моноцитов, эозинофилов и базофилов в ПК и концентрате мононуклеарной фракции ПК.

Абсолютное количество субпопуляций лимфоцитов (CD3+клетки, CD19+клетки, CD3+CD4+клетки, CD3+CD8+клетки, CD16+CD56+клетки, HLA-DR+клетки) также повышается в процессе процедуры концентрации, но статистически незначимо. Степень повышения повторяет динамику лимфоцитов, определенную при помощи автоматического счетчика клеток крови.

Полученные данные позволили охарактеризовать состав лимфоцитов ПК и продемонстрировали отсутствие влияния процедуры концентрации ПК на количество и состав CD3+лимфоцитов в сочетании с достоверным увеличением после концентрации доли NK-клеток и CD33+CD13+клеток. Доля натуральных киллеров (NK) CD16+CD56+клеток среди ядросодержащих клеток пуповинной крови составила 5,97 ± 0,67% и статистически значимо увеличилась после процедуры концентрации – 8,54 ± 0,91% (р = 0,027). Такое соотношение связано с тем, что при проведении процедуры концентрации лейкоцитов ПК, происходит статистически незначительная потеря лейкоцитов вместе с седиментирующимися эритроцитами, за счет эозинофилов, базофилов и моноцитов и, следовательно, относительное количество NK-клеток и миелоидных предшественников возрастает. Количество CD3+лимфоцитов, опосредующих развитие РТПХ, в результате процедуры лейкоконцентрации практически не менялось и составило 17,9 ± 1,44% и 19,2 ± 1,4% от всех ядросодержащих клеток соответственно. Количество и соотношение субпопуляций CD3+лимфоцитов – CD3+CD4+клеток и CD3+CD8+клеток в процессе концентрации также не изменилось и составило до концентрации CD3+CD4+клетки – 12,62 ± 1,12%, CD3+CD8+клетки – 5,62 ± 0,53%; после концентрации CD3+CD4+клетки – 13,23 ± 1,12%, CD3+CD8+клетки – 5,52 ± 0,48% от всех ядросодержащих клеток. Относительное количество предшественников миелопоэза – D33+CD13+клеток составила 12,5 ± 0,76% и статистически значимо увеличилось 15,82 ± 0,81% (р=0,005) после процедуры выделения, что может быть связано с большей потерей гранулоцитов при проведении процедуры выделения. Доля активированных лимфоцитов в результате лейкконцентрации также не изменилась и составила 0,40 ± 0,08% до выделения и 0,38 ± 0,09% после выделения. Количество CD14+клеток не увеличилось и составило 8,65 ± 1,58% до выделения и 9,11 ± 1,76% после.

Количество CD15+клеток имело тенденцию к снижению, по-видимому, вследствие большей потери при процедуре выделения по сравнению с остальными субпопуляциями лейкоцитов и составило 39,32 ± 3,45% до выделения и 35,23 ± 3,26% после.

Полученные данные имеют важное практическое значение при проведении планирования технологического процесса, так как показано, что при проведении процедуры концентрации ПК, основанной на процессе седиментации эритроцитов под действием гидроксиэтилкрахмала, доля нейтрофилов не изменяется, доля лимфоцитов статистически значимо повышается за счет снижения доли моноцитов, эозинофилов и базофилов. Процедура лейкоконцентрации не влияет на количество CD3+клеток, в том числе CD3+CD4+клеток и CD3+CD8+клеток и активированных лимфоцитов – CD25+клеток.

В результате процедуры лейкоконцентрации статистически значимо увеличилась доля CD19+клеток и натуральных киллеров (NK) CD16+CD56+клеток. Процедура лейкоконцентрации не влияет на содержание CD34+клеток CD133+клеток и субпопуляций. Таким образом, результаты работы позволили получить референтные значения показателей состава лейкоцитов ПК, которые рекомендуется использовать в качестве факторов определяющих показания и противопоказания к сбору ПК для безвозмездного донорства ГСК.

При сравнении полученных результатов выявлено, что при аппаратном методе обработки пуповинной крови (МАВК) выделение лейкоцитов в целом меньше, чем при ручном (двойном центрифугировании) (72,4±0,45 – ручной; 70,28±0,51 – аппаратный; p=0,002). Однако выделение мононуклеаров и лимфоцитов значительно выше, чем при ручном методе (MNC: 70,11±0,49 – ручной; 77,94±0,53 – аппаратный; p<0,0001; лимфоциты: 71,7±0,54 – ручной; 80,73±0,58 – аппаратный; p<0,0001). Редукция же эритроцитов при аппаратном методе выделения значительно выше, чем при ручном (36,45±0,51 – ручной; 20,85±0,5 – аппаратный; p<0,0001).

Оптимизация исследования HLA–фенотипа пуповинной и периферической крови у пациентов при различных заболеваниях

Типирование пуповинной крови по HLA-системе имеет свои специфические особенности: быстрота обработки большого количества биоматериала при ограниченном количестве крови каждого образца и невозможности его повторного сбора. Поэтому использование чувствительных методов HLA-типирования, требующих для исследования минимального количества ДНК, является критическим фактором.

Впервые в России была апробирована и успешно внедрена технология обратной дот-блот гибридизации с олигонуклеотидными зондами (SSO) в автоматическом режиме на процессоре Dynal autoRELI™ 48 mk, позволяющая проводить скрининговое HLA-типирование большого количества образцов. Одним из несомненных достоинств этой технологии является ее большая пропускная способность и возможность использования минимального количества исследуемого материала - около 40 мкл ДНК (концентрация 13 - 15 мкг/мкл). Весь рабочий процесс осуществляется за 2,5 часа. Однако, основным недостатком данного метода является возникновение двойных интерпретаций результатов типирования. Особенно это касается локусов HLA-B и HLA-DRB (около 13% случаев по каждому из них). По локусу HLA-A было получено около 6% случаев с неоднозначной интерпретацией результатов, по локусу HLA-Cw – 8,5% случаев, по HLA-DQB1- 1,5%. Для разрешения неоднозначной интерпретации результатов типирования этих образцов проводилось повторное типирование с применением метода ПЦР с аллель-специфическими праймерами (SSP), что позволило достичь 100% однозначности результатов.

Для разрешения двойной интерпретации был использован метод типирования с помощью аллель-специфических праймеров (SSP). Интерпретация полученных данных осуществлялась с помощью таблиц, где определенная комбинация сигнальных полосок соответствовала определенной группе аллелей гена.

В настоящее время в реестре неродственных доноров хранится 3964 образца ГСК, типированные по пяти локусам системы HLA-A, -B, -Cw, -DRB, -DQB1. Были выявлены 17 специфических групп аллелей локуса HLA-A, 32 специфичности локуса HLA-B, 14 специфичностей локуса HLA-Cw, 14 специфичностей гена HLA-DRB1 и 5 специфичностей гена DQB1. Частота тех или иных генов гистосовместимости среди доноров стволовых клеток во многом зависит от этнических признаков входящих в неё лиц.

Анализ распределения HLA-специфичностей (специфических групп аллельных вариантов) у московской популяции определил, что наиболее часто встречаемыми по локусам класса I являются (в долях): HLA-A*02 (0,288), A*03 (0,134), A*01 (0,114), A*24 (0,096); HLA-B - B*07 (0,120), B*35 (0,0793), B*44 (0,101), B*18 (0,084), B*08 (0,067), B*13 (0,066); Cw*07 (0,257), Cw*12 (0,134), Cw*06 (0,130), Cw*04 (0,0128).

По классу II c наибольшей частотой встречаются следующие группы аллелей гена DRB1 – *07 (0,143), *13 (0,139), *15 (0,133), *11 (0,130), *01 (0,110), *04 (0,110) и группы аллелей гена DQB1 – *03 (0,330), *06 (0,222). Наиболее редко встречающимися группами аллелей были выявлены следующие: A* 69 (0,0033), A*34 (0,00035), A*80 (0,00035), B*47 (0,0036), B* 45 (0,002), B*46 (0,002), B*53 (0,0017), B* 73 (0,0015), B*54 (0,0003) и B*78 (0,0003).

Проведенные исследования и анализ литературных данных (Зарецкая Ю.М., 2008) свидетельствуют, что характер распределения генных частот HLA класса I и II в популяции московского региона в целом соответствуют таковому для европеоидов.

Характер распределения частоты встречаемости генов HLA-системы у детей с ОЛЛ.

Были обследованы 187 детей с ОЛЛ из различных регионов России. Для изучения характера распределения генов HLA-системы пациенты, больные ОЛЛ, были разделены в зависимости от их иммунологического варианта на 2 группы: на В-ОЛЛ и Т-ОЛЛ. Была исследована группа из 98 детей с В-ОЛЛ (57 мальчиков и 41 девочка) (средний возраст составил 8,2 лет ± 4,8). Особенности характера распределения генов гистосовместимости в этой группе больных по сравнению с контрольной группой здоровых детей представлены на рис. 5 и в таблице 9.

Рисунок 5. Частота встречаемости HLA-специфичностей у детей, больных В-ОЛЛ.

Частота встречаемости генов HLA-системы была высокой в группе больных В-ОЛЛ по сравнению со здоровыми детьми по локусу HLA-A - A*32; по локусу HLA-B – B*15, B*50; В*47 по локусу HLA-C – Cw*04; Сw*16 по локусу HLA-DRB – DRB1*09 и DRB1*14.

Для изучения факторов риска развития заболевания использовали метод случай-контроль. Если этот показатель превышал OR > 2, то он считался значимым (Зарецкая Ю.М., 1983). При разделении пациентов по полу были выявлены особенности распределения в частоте встречаемости HLA-специфичностей с этим заболеванием (рис. 6). В контрольной группе различий по полу выявлено не было.

Рисунок 6. Частота встречаемости HLA-специфичностей у мальчиков и девочек В-ОЛЛ.

Таблица 9. Иммуногенетические факторы предрасположенности и устойчивости к развитию В - ОЛЛ у детей.

HLA- специи-фичности Дети (мальчики и девочки) n=98 Мальчики n=57 Девочки n=41
p OR CI EF/ PF,% p OR CI EF/ PF,% p OR CI EF/ PF,%
A*32 0,04 2,1 1,19 4,71 5,7 - - - - 0,03 2,9 1,21 7,03 10,2
B*15 0,002 2,3 1,38 3,78 11,80 - - - - 0,02 2,6 1,20 5,05 13,8
B*50 0,03 2,6 1,16 6,02 4,3 0,03 3,3 1,26 8,66 6,2 - - - -
B*47 - - - - - - - - 0,009 10,9 2,96 40,37 6,8
Cw*04 0,007 1,9 1,21 3.05 17,4 0,05 1,95 1,06 3,58 18,3 0,02 2,56 1,18 5,51 27,1
Cw*16
- - - - 0,016 3,7 1.40 9,65 8.1 - - - -
DRB1*03 - - - - 0,037 0,3 In:3,4 0,10 0,97 11,0 0,04 2,2 1,11 4,30 15,5
DRB1*09 0,0011 3,5 1,68 7,54 6,3 3,3 3.3 1,27 8,74 6,4 0.05 4,0 1.35 11,65 7,5
DRB1*14 0,002 3,1 1,54 6,33 6,6 1,95 5,1 2,35 10,73 13,0 - - - -

n количество больных детей; р – уровень достоверности;

OR (odds ratio) – отношение шансов; In – инвертированный показатель (1/OR)

CI (confidence interval) – доверительный интервал; EF/PF – этиологическая /превентивная фракция

Были исследованы 37 детей больных Т-ОЛЛ (25 мальчиков и 12 девочек) (средний возраст составил 10,1 лет ± 4,9). Отличительные особенности характера распределения HLA-генов в этой группе по сравнению со здоровыми детьми представлены на рис.7 и табл. 10.

Рисунок 7.Частота встречаемости специфичностей HLA у детей больных Т-ОЛЛ

Таблица 10. Иммуногенетические факторы предрасположенности к развитию T-линейного ОЛЛ у детей

HLA-специфичности Дети (мальчики и девочки), n=37 Мальчики, n=25
p OR CI EF,% p OR CI EF,%
A*26 - - - - 0,006 3,7 1,53 9,04 20,0
B*14 0,05 3,0 1,15 7,92 9,5 - - - -
DRB1*01 0,0035 2,2 1,10 4,22 19,8 - - - -
DRB1*13 0,002 2,35 1,21 4,51 25,5 0,03 2,55 1,14 5,54 29,0
DQB1*05 0,002 2,45 1,19 5,04 34,5 - - - -

р – уровень достоверности; OR (odds ratio) – отношение шансов, CI (confidence interval) – доверительный интервал, EF– этиологическая фракция

Общая группа (все ОЛЛ) была представлена 187 детьми (112 мальчиков и 75 девочек) (средний возраст составляла 8,0 лет ±). При анализе полученных данных были выявлены отклонения в распределении частоты встречаемости HLA-специфичностей В*50, Cw*04, DRB1*09, DRB1*14 по сравнению с контрольной группой здоровых детей (табл. 11).

Таким образом, можно заключить, что варианты В-ОЛЛ и Т-ОЛЛ имеют разные иммуногенетические маркеры предрасположенности и устойчивости к данным заболеваниям. Более того, выявленные маркеры имеют разную силу ассоциации с заболеванием в зависимости от пола ребенка. Обнаружено, что у мальчиков и у девочек имеются свои специфические маркеры к разным иммунофенотипическим вариантам ОЛЛ.

Таблица 11. Иммуногенетические факторы предрасположенности и устойчивости к развитию ОЛЛ у детей, (общая группа, n=187)

HLA- специ- фичности Маркеры предрасположенности Маркеры устойчивости
р CI OR CI EF,% р CI OR CI PF,%
B*37 0,017 1,27 4,15 2,7 1,26 5,77 2,7 - - - - -
B*50 0,012 1,26 3,57 2,4 1,25 4,65 3,4 - - - - -
B*58 0,003 1,17 3,86 2,4 1,15 5,18 2,6 - - - - -
Cw*04 0,05 1,05 1,97 1,5 1,05 2,13 - - - - - -
DRB1*09 0,01 1,25 3,37 2,4 1,25 4,45 3,3 - - - - -
DRB1*14 0,002 1,39 3,35 2,5 1,42 4,41 4,5 - - - - -
В*13 - - - - - 0.03 0.31 0.93 0.50 I:2.0 0.29 0.91 5.6
DQB1*02 - - - - - 0.007 0.47 0.88 0.6 In:1.6 0.44 0.87 13.8

p – уровень достоверности; OR– отношение шансов, CI– доверительный интервал;

EF/PF – этиологическая /превентивная фракция

Характер распределения частот встречаемости генов HLA- системы у детей с ОМЛ.

Были исследованы 146 детей, больных ОМЛ, (средний возраст составил 8,9 лет ± 5,2), по этническим признакам относящиеся к популяции европеоидов и разделенные на группы: ОМЛ М2 (28 детей), ОМЛ М4 (26 детей), ОМЛ М5 (28 детей) и ОМЛ М7 (18 детей). Дети с М0, М1и М6 вариантами в исследование не были включены из-за их малочисленности (всего 14 детей). Исследования по выявлению HLA–ассоциированных генов с вариантом промиелоцитарного лейкоза (М3) не проводились, так как типирование антигенов гистосовместимости у них не осуществлялось. У 32 детей больных ОМЛ морфологические варианты не были выявлены. Из-за малочисленности группы больных ОМЛ статистическая обработка результатов HLA-типирования в зависимости от пола не проводилась.

В результате проведенных исследований (рис. 8-11) у больных детей с ОМЛ были обнаружены достоверные отклонения от нормального распределения HLA-генов.

Рисунок 8 Частота встречаемости HLA-специфичностей у детей, больных ОМЛ М-2.

Рисунок 9. Частота встречаемости HLA-специфичностей у детей, больных ОМЛ М-4.

Рисунок 10. Частота встречаемости HLA-специфичностей у детей, больных ОМЛ М5.

Рисунок 11. Частота встречаемости HLA-специфичностей у детей, больных ОМЛ М7.

Таким образом, можно заключить, что различные морфологические варианты ОМЛ имеют многообразные иммуногенетические маркеры предрасположенности и устойчивости к этому заболеванию.

С целью выявления «общего маркера» для миелобастного лейкоза была исследована общая группа всех больных детей (146 пациентов) с ОМЛ, независимо от варианта, а также пола и возраста ребенка (табл. 12). Из них было 88 мальчиков и 58 девочек. Был обнаружен целый ряд аллелей HLA-генов с достоверно аномальным их распределением у детей, больных ОМЛ, по сравнению с контрольной группой у здоровых детей. Это специфичности относящиеся, как к классу I – A*24, A*68, C*05, Cw*07, так и к классу II – DRB1*11, DRB1*07, DQB1*02.

Таблица 12. Иммуногенетические факторы предрасположенности и устойчивости к развитию ОМЛ у детей (n=146).

HLA-специ- фичности Маркеры риска Маркеры устойчивости
р OR CI EF,% р OR CI PF,%
A*24 0,02 1,820 1,08-2,41 - - - - -
A*68 0,04 1,8 1,06-3,06 - - - - -
Cw*05 0,05 2,2 1,257-4,089 7,8 - - - -
Cw*07 0,0001 2,1 1,45-3,22 35,5 - - - -
DRB1*11 0,05 1,5 1,02-2,08 - - - - -
DRB1*07 - - - - 0,001 0,6-In:1,7 0,36-0,88 11,0
DRQB1*02 - - - - 0,03 0,6 In:1,7 0,41-0,93 15,0


Pages:   || 2 |
 
Похожие работы:

«КАРЯН Гоар Левоновна ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО И ПСИХОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА У ДЕТЕЙ С ПАТОЛОГИЕЙ ВЕРХНИХ ОТДЕЛОВ ЖКТ И ПРЕВЫШЕНИЕМ МАССЫ ТЕЛА 14.00.09 - педиатрия 14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва -2008 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по...»

«Сарапулова Н.Ю.2011 год.docx Общая магнитотерапия в комплексном восстановительном лечении пациентов, перенесших холецистэктомию тема диссертации и автореферата по ВАК 14.03.11, кандидат медицинских наук Сарапулова, Наталья Юрьевна Год:  2011 Автор научной работы:  Сарапулова, Наталья Юрьевна Ученая cтепень:  кандидат медицинских наук Место защиты диссертации:  Москва Код cпециальности ВАК:  14.03.11 Специальность:  Восстановительная медицина, спортивная медицина, лечебная физкультура,...»

«КОЗЛОВ АНДРЕЙ ВИКТОРОВИЧ ХИРУРГИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ ТРОФИЧЕСКИХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ НАРУШЕНИЙ ПРИ ТРАВМЕ ВЕРХНЕЙ КОНЕЧНОСТИ 14.01.17 – хирургия 14.01.15 – травматология и ортопедия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Новосибирск – 2010 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному...»

«ПИРОГОВА ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИНФОРМАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ КАК КРИТЕРИЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ МЕДИЦИНСКИХ ОРГАНИЗАЦИЙ ДЕРМАТОВЕНЕРОЛОГИЧЕСКОГО ПРОФИЛЯ 14.01.10 – кожные и венерические болезни 14.02.03 – общест ­ венное здоровье и здравоохранение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва, 2012 г. Работа выполнена в отделе дерматологии Федерального государственного бюджетного учреждения Государственный научный центр...»

«КОЗЫРИЦКАЯ ДАРЬЯ ВЛ А ДИМИРОВНА Клиническое значение МЕТАБОЛИТОВ ОКСИДА АЗОТА ПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ У ДЕТЕЙ 14.00.09 – педиатрия...»

«ЗАХАРОВА ОЛЬГА ПАВЛОВНА Компьютерно-томографические признаки резектабельности рака поджелудочной железы 14.01.13 - лучевая диагностика, лучевая терапия http://rncrr.ru А В Т О Р Е Ф Е Р А Т диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2012 г. Работа выполнена в ФГБУ Институт хирургии им. А.В.Вишневского Минздравсоцразвития России (директор – академик РАМН, профессор В.А. Кубышкин). НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ : доктор медицинских наук, профессор...»

«КАДЗАЕВА Зарина Казбековна КАРДИОПРОТЕКТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ КОРРЕКЦИИ АНЕМИИ ПРИ ТЕРМИНАЛЬНОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ У БОЛЬНЫХ, НАХОДЯЩИХСЯ НА ПРОГРАММНОМ ГЕМОДИАЛИЗЕ 14.01.04 - Внутренние болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Владикавказ - 2012 г. Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Северо-Осетинская государственная медицинская академия Министерства...»

«Басок Юлия Борисовна Оценка эффективности трансдермальных терапевтических систем на основе анализа фармакокинетических параметров (экспериментальное исследование) 14.00.41 – Трансплантология и искусственные органы 14.00.25 – Фармакология, клиническая фармакология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2009 Работа выполнена в ФГУ Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Щумакова...»

«СОШИНА Александра Альбертовна СОСТОЯНИЕ КЛИНИКО - ЭКСПЕРТНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ, КАТЕГОРИЙ ОГРАНИЧЕНИЙ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ И РЕАБИЛИТАЦИИ С УЧЕТОМ ПОЛОЖЕНИЙ МЕЖДУНАРОДНОЙ КЛАССИФИКАЦИИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ У БОЛЬНЫХ РАЗЛИЧНЫМИ КЛИНИЧЕСКИМИ ФОРМАМИ ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНИ 14.01.04 – внутренние болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург – 2013 Работа выполнена на кафедре терапии, медико-социальной экспертизы и реабилитации № 2...»

«Чурина Елена Георгиевна ОСОБЕННОСТИ ИММУНОПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЯВЛЕНИЙ АТОПИЧЕСКОГО ДЕРМАТИТА 14.00.16 – патологическая физиология 14.00.36 – аллергология и иммунология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук ТОМСК - 2007 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Научные...»

«АЛБЕГОВА ЖАННА КУЦУКОВНА ПАТОГЕНЕЗ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ПРОФИЛАКТИКА ЭНТЕРОСОРБЕНТАМИ НЕФРО- И КАРДИОПАТИЙ, ВЫЗВАННЫХ ЦВЕТНЫМИ МЕТАЛЛАМИ 14.03.03 – патологическая физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук ВЛАДИКАВКАЗ – 2012 Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Северо-Осетинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального...»

«ПЕТРОВ АЛЕКСЕЙ СЕРГЕЕВИЧ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ХИРУРГИЧЕСКОЙ ТАКТИКИ ПРИ ОБТУРАЦИОННОЙ ТОЛСТОКИШЕЧНОЙ НЕПРОХОДИМОСТИ 14.03.01 – анатомия человека 14.01.17 – хирургия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном казенном военном образовательном учреждении высшего профессионального образования Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова Министерства обороны...»

«Котлярова Галина Владимировна Особенности системы гемостаза у больных терминальной почечной недостаточностью 14.01.29 - нефрология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2011 Работа выполнена в ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Евгений Михайлович Шилов Официальные оппоненты: доктор медицинских...»

«Степанов РОМАН ВИКТОРОВИЧ Комплексная лучевая диагностика в оценке репаративного процесса при лечении больных с закрытыми диафизарными переломами костей голени 14.01.13 - лучевая диагностика, лучевая терапия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук http://rncrr.ru Москва – 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении Российский научный центр Восстановительная травматология и ортопедия имени академика Г.А. Илизарова...»

«МИЛОВАНКИНА НЕОНИЛА ОЛЕГОВНА КЛИНИКО-ГИГИЕНИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРОГРАММЫ МЕДИЦИНСКОЙ РЕАБИЛИТАЦИИ РАБОЧИХ ГРУППЫ РИСКА РАЗВИТИЯ ПРОФЕССИОНАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ В ТРУБНОМ ПРОИЗВОДСТВЕ 14.02.04 Медицина труда АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук...»

«Л А Р Ч Е Н К О И г о р ь А н а т о л ь е в и ч УДК 616.441-006.5-089 ОПТИМИЗАЦИЯ ДИАГНОСТИКИ И ВРАЧЕБНАЯ ТАКТИКА ПРИ УЗЛОВЫХ ОБРАЗОВАНИЯХ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ. 14.00.27 - хирургия А В Т О Р Е Ф Е Р А Т диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва 1999 год Диссертация выполнена в Медицинском центре Управления делами Президента Российской Федерации. Научный консультант Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Н.Н.МАЛИНОВСКИЙ...»

«ПТИЧКИНА Полина Александровна СОСТАВ ТЕЛА И МАРКЕРЫ ЖИРОВОГО МЕТАБОЛИЗМА У ЖЕНЩИН В ПОСТМЕНОПАУЗЕ С РАЗНЫМ 10-ЛЕТНИМ РИСКОМ ФАТАЛЬНЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ. 14.01.05 – Кардиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2012 Работа выполнена в ФГБУ Государственный научно-исследовательский центр профилактической медицины Министерства здравоохранения Российской Федерации





наверх



 
<<  ГЛАВНАЯ   |    КОНТАКТЫ
2014 www.avtoreferat.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.