WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 |

Фармакологические свойства и клинические эффекты белково-полимерных лекарственных средств, созданных электронно-лучевым синтезом

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Мадонов Павел Геннадьевич

«Фармакологические свойства и клинические эффекты

белково-полимерных лекарственных средств,

созданных электронно-лучевым синтезом»

14.03.06 фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

ТОМСК 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН,

заслуженный деятель науки РФ Удут Владимир Васильевич

Официальные оппоненты:

Венгеровский Александр Исаакович, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный работник высшей школы РФ, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, кафедра фармакологии, заведующий кафедрой

Дурнев Андрей Дмитриевич, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова» Российской академии медицинских наук, лаборатория лекарственной токсикологии, руководитель лаборатории

Грек Олег Рувимович, доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, кафедра фармакологии, заведующий кафедрой

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н. И. Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «________» ______________ 2012 г. в_____ часов на заседании

диссертационного совета Д 001.031.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан «________» ______________ 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Обеспечение лекарственной безопасности России, как одной из важнейших составляющих её независимости, обозначено первостепенной задачей на ближайшее десятилетие. Действительно, в настоящее время объем потребления лекарственных препаратов, производимых в Российской Федерации, составляет не более 20 процентов рынка в денежном выражении и не более 65 процентов в натуральном. Отечественные производители лекарственных средств проигрывают в рыночной конкуренции не только крупнейшим мировым фармацевтическим корпорациям, разрабатывающим инновационные препараты, но и производителям воспроизведенных лекарственных средств (ФЦП "Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу", утверждена Постановлением Правительства Российской Федерации от 17 февраля 2011 г. N 91). В ходе реализации Программы планируется, в том числе, решить следующую задачу: ускоренное формирование научно-технологического потенциала для разработки импортозамещающих и инновационных лекарственных средств, медицинской техники и изделий медицинского назначения на основе выполнения масштабных научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ (стр.6 ФЦП «Фарма 2020»).

Решение этой проблемы видится в развитии отечественных фармпредприятий, ориентированных на выпуск импортзамещающих и оригинальных лекарственных средств, что настоятельно диктует необходимость разработки и освоения новых технологических решений по синтезу или модификации лекарственных препаратов обладающих высокой безопасностью и эффективностью. Особенно это актуально для фармакологических средств белковой природы.

В клинической практике лекарственные препараты этой группы применяются достаточно широко в силу высокой эффективности и специфичности. При этом белковые фармакологические средства не всегда имеют выгодный фармакокинетический профиль, а при энтеральном приёме их биодоступность не превышает 1,5 % (Ram I. Mahato, Ajit S. Narang, Laura Thoma, 2003). Кроме того, общеизвестно, что белковые молекулы аллергогенны и иммунотоксичны.

Таким образом, главное противоречие использования белковых фармакологических средств заключается в их высокой клинической эффективности и ограничениях применения - парентерально ввиду токсичности, а энтерально - ввиду низкой биодоступности.

Возможность устранения обозначенного противоречия видится в создании их модифицированных лекарственных форм: полимер-белковых конъюгатов для парентерального и энтерального введения, микрокапсулирования, и т.д. (И. Г. Никитин, Т.Н. Сторожаков,2002.)

Работы в этом направлении ведутся с 1970-х годов, когда предпринимались попытки применять ковалентное присоединение полимеров для повышения безопасности и эффективности различных протеинов (патент США № 4179337). Использовалось связывание полиэтиленоксида с аденозиндезаминазой для лечения иммунодефицитных состояний (Дэвис С.,1981; Хершфилд, М. С.,1987), связывание полиэтиленоксида с супероксиддисмутазой для лечения хронических воспалительных заболеваний (патенты США № 5006333, 5080891).

Действительно, наибольшую привлекательность в повышении эффективности, снижении аллергогенности и токсичности лекарственных препаратов белковой природы представляет их модификация, состоящая не в изменении структуры, что, несомненно, сказывается на специфичности и эффективности, а в физико-химической трансформации, достигаемой соединением белковой молекулы с полимерным носителем. В настоящее время известно достаточно большое количество модифицирующих полимеров как природного, так и синтетического происхождения.

Особое значение в этом плане отводится полиэтиленгликолям различной молекулярной массы, сополимерам этиленоксида и пропиленоксида, а так же некоторым полисахаридам. При этом полиэтиленгликоль/полиэтиленоксид (ПЭГ/ПЭО) и его сополимеры используются чаще всего (Caliceti P., Veronese F.M., 2003). Феномен присоединения молекулы полиэтиленгликоля к другой молекуле носит название пегиляция или пегилирование (Duncan R., Spreafico F., 1994, Harris J.M., Martin N.E., Modi M., 2001).

Первые работы по успешному пегилированию лекарственных препаратов опубликованы в прошлом веке (Duncan R., Spreafico F.,1994). В начале нынешнего столетия число исследований, посвященных этой проблеме, постоянно росло, что демонстрирует большой интерес к данной технологии (Takagi A., Yamashita N., Yoshioka T. е.a., 2007; Bailon P., Won C.Y., 2009; Дыгай А.М., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 2009; 2010; 2011; El-Komy M.H., Widness J.A., Veng-Pedersen P., 2011).

Синтез ПЭГ-белок, ПЭГ-пептид, ПЭГ-олигонуклеотид в последнее десятилетие стал часто использоваться для улучшения фармакокинетических свойств и токсикологических характеристик известных лекарственных препаратов. Для этих целей в подавляющем большинстве случаев используется химический синтез, позволяющий пегилировать различные антигены, антитела, факторы роста, клеточные рецепторы, ферменты, олигонуклеотиды и др. Некоторые из полученных указанным способом препаратов одобрены для использования в клинической практике во многих странах мира («Neulasta», «Mircera», «Pegasys» и др.) (Heathcote E.J., Shiffman M.L., Cooksley W.G. e.a., 2000; Curran M.P., Goa K.L., 2002; Hamidi M., Azadi A., Rafiei P., 2006; Kobbe G., Bruns I., Fenk R. е.а., 2009; Mallorqu J., Gutirrez-Gallego R., Segura J. е.а., 2010).

При этом химический синтез «полимер-лекарство» является весьма сложным многоступенчатым и дорогостоящим технологическим процессом, с применением высокотоксичных реагентов, требующих использования многочисленных стадий очистки с целью получения гомогенной популяции модифицированных молекул (Patent № LU91006, 2003; Piedmonte D.M., Treuheit M.J., 2008). Тем не менее, результатом синтеза белка и полимера является изменение фармакокинетических и фармакодинамических параметров соединения за счет повышения его стабильности, увеличения времени жизни в организме. И, как показала уже клиническая практика, появляется возможность энтерального использования лекарственного средства. На этом фоне имеет место снижение токсичности и увеличение избирательности действия синтезированного продукта (Nucci M.L., Olejarczyk J., Abuchowski A., 1986; Delgado C., Francis G.E., Fisher D., 1992; Francis G.E., Fisher D., Delgado C. е.a., 1998; Chinol M., Casalini P., Maggiolo M., 1998; Bruce A., 2001; Avgoustakis K., 2004; Maullu C., Raimondo D., Caboi F. e.a., 2009; Huang Z., Ni C., Chu Y., Wang S. е.а., 2009).

Таким образом синтез «полимер-лекарство» по крайней мере в отношении пегилированных белковых молекул, обеспечивает неоспоримые преимущества лекарственных средств белковой природы. Единственным ограничением создания инновационных продуктов этого направления выступает сложность технологии химического синтеза и, следовательно, кратное повышение стоимости лекарственных средств подобного плана.

Однако существует альтернатива многоступенчатому процессу химической пегиляции – электронно-лучевой синтез. Изучение и понимание общих принципов образования и свойств соединений «полимер-лекарство», полученных при помощи ионизирующего излучения, представляет большой интерес для фармакологии в рамках улучшения фармакокинетических свойств лекарственных препаратов белковой природы и уменьшения их токсических эффектов. (Vereschagin E.I., Khan D.H., Troitsky A.W. e. a., 2001; Патент RU № 2406528, 2010; Патент RU № 2405822, 2010; Патент RU № 2414926, 2011). В качестве источника воздействия наиболее предпочтительным является использование потока ускоренных электронов, а в качестве носителя – низкомолекулярного ПЭГа (Дыгай А.М., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 2009; 2010; 2011; Дыгай А.М., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н. и др., 2009; 2011).

В связи с вышеизложенным, разработка новой технологии электронно-лучевого синтеза «полимер-лекарство» представляется актуальной и своевременной, открывающей новые перспективы совершенствования лекарственных средств белковой природы.

Цель исследования. Изучить возможности электронно-лучевого синтеза белковых молекул с полиэтиленгликолем для создания новых фармакологических средств с оценкой их токсичности, переносимости, специфической активности и фармакокинетики.

Задачи исследования:

  1. На примере двух различающихся по химическим и фармакологическим свойствам белковых молекул показать возможности электронно-лучевого синтеза с полиэтиленгликолем для создания пегилированных фармакологически активных лекарственных средств;
  2. Изучить физико-химические свойства созданных посредством электронно-лучевого синтеза пегилированных белковых молекул;
  3. Изучить фармакодинамические свойства созданных посредством электронно-лучевого синтеза пегилированных белковых молекул;
  4. Изучить параметры фармакокинетики созданных посредством электронно-лучевого синтеза пегилированных белковых молекул;
  5. Оценить токсические эффекты созданных посредством электронно-лучевого синтеза пегилированных белковых молекул;
  6. На примере лекарственного средства - пегилированного субтилизина, созданного посредством электронно-лучевого синтеза, показать терапевтические возможности по соотношению клиническая эффективность/безопасность;
  7. Обосновать возможности технологии электронно-лучевого синтеза для создания новых, инновационных лекарственных препаратов, обладающих оптимальным соотношением польза/риск.

Научная новизна.

В результате изучения возможностей использования пучка ускоренных электронов для синтеза белково-полимерных лекарственных средств были получены уникальные данные по возможности создания новых, оригинальных фармакологически активных молекул. Исследования не ограничились фармакологическими свойствами и клиническими эффектами, а имели расширенный характер за счёт изучения межмолекулярных взаимодействий под воздействием пучка ускоренных электронов. Были установлены механизмы воздействия радиационного облучения на молекулу ПЭГ, зависимость дозы, концентрации, температуры и др.. Установлено различие в механизмах взаимодействия молекул ПЭГ с молекулами белка в водных растворах при облучении. Для низкомолекулярных ПЭГ возможно присоединение только по концевой группе полимера, тогда как для высокомолекулярных ПЭГ данное взаимодействие возможно с образованием более сложных структур посредством водородных связей. В молекуле ПЭГ под пучком ускоренных электронов происходит дозозависимое накопление карбонильных группировок. После облучения у высокомолекулярных ПЭГов наблюдается эффект перехода в состояние предгелирования (образование ассоциатов, обладающих сверхвысокими молекулярными массами), что может быть обусловлено процессом кросслинкинга. В растворах низкомолекулярных ПЭГ протекают процессы связывания между отдельными короткими цепями полимера по радикальному механизму. Облучение ПЭГ свободными электронами инициирует переход от линейной структуры к сетчатой вне зависимости от молекулярной массы облучаемого полимера. Результаты исследований был подтверждён ковалентный характер связей, возникающий между белком и молекулами после облучения потоком ускоренных электронов. Установлено, что прочность образовавшейся связи зависит преимущественно от дозы облучения, например, 0,5Мрад и 0,75Мрад в определённых соотношениях концентрации белка и ПЭГ не обеспечивают достаточно прочной связи.

На этапе изучения фармакологических свойств было показано, что белок-полимерный комплекс вне зависимости от пути введения достаточно быстро достигает системного кровотока. На примере комплекса ПЭГ-ГКСФ, показано, что время достижения максимальных концентраций при подкожном и ректальном введении составило 1 час, а при внутрижелудочном введении 10 мин. Значения максимальных концентраций достигнутых при этом лежат в диапазоне 1700-2500 пг. При определении токсичности достигнутые дозы комплекса ПЭГ-ГКСФ многократно превышают терапевтические, применяемые в клинической практике - от 300 до 1500 раз. При этом специфичность действия, присущая нативной молекуле ГКСФ, сохранялась прежней. При исследовании лекарственного средства на основе пегилированного, посредством электронно-лучевого синтеза, фермента-субтилизина молекулярной массой 30 кДа, установлены ещё более показательные фармакологические эффекты. Фермент-полимерный комплекс оказывал выраженный фибринолитический и тромболитический эффект, присущий нативному ферменту. Наряду с сохранённой специфичностью действия пегилированный препарат всасывался из кишечника с биодоступностью 16-18 %, а при парентеральном введении не оказывал токсических эффектов. В настоящее время по сумме данных качеств на фармацевтическом рынке подобного препарата нет.

Практическая значимость.

Представленная технология электронно-лучевого пегилирования белковых препаратов формулирует конкретные практические предложения для фармацевтической промышленности и здравоохранения. Метод электронно-лучевой пегиляции позволяет синтезировать различные конструкции целевого белка с полимером. В зависимости от необходимых фармакокинетических, фармакодинамических и токсикологических характеристик перспективного лекарственного препарата можно воспользоваться той или иной технологической схемой. Электронно-лучевое пегилирование белковой молекулы способно изменить фармакокинетические показатели, особенно в части повышения энтеральной биодоступности, снизить токсичность, обеспечить невысокую стоимость конечного продукта. Лекарственные препараты на основе пегилированных белков, созданные по технологии ЭЛП комплаентны для пациентов за счёт возможности использовать твёрдые лекарственные формы (капсулы, таблетки, суппозитории), безопасны с точки зрения иммунотоксичности и аллергогенности. Эти лекарственные препараты могут использоваться человеком достаточно долгое время и несколькими курсами для лечения тяжёлых хронических дегенеративных заболеваний.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Технология электронно-лучевого синтеза фармакологически активного белка с полиэтиленгликолем позволяет создавать соединения ПЭГ-Белок со стабильными физико-химическими свойствами, обладающие фармакодинамикой, присущей нативному белку;
  2. Технология электронно-лучевого синтеза фармакологически активного белка с полиэтиленгликолем различной молекулярной массы позволяет модифицировать фармакокинетические характеристики соединения ПЭГ-Белок. Позволяет создавать лекарственные препараты белковой природы с высокой терапевтической активностью и низкой токсичностью.

Апробация работы

Основные положения работы представлены на 3-м Съезде токсикологов России (Москва, 2008), на Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2009), на Объединенном съезде по кардиологии и кардиохирургии СФО (Томск, 2009), на IV Национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2009), на XVI Российском конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010), на научно-практической конференции ЦФО РФ с международным участием «Инновации и информационные технологии в диагностической, лечебно-профилактической и учебной работе клиник» (Тверь, 2010), на 2-й всероссийской научно-практической конференции «Учёные Урала и Сибири – развитию отечественной фармации» (Новосибирск, 2011), на Всероссийской научной конференции «Фармакологическая регуляция стволовых клеток» (Томск, 2011), на Всероссийской научной конференции «Современная лекарственная токсикология» (Томск, 2012).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 2 монографии, 40 печатных работ, в том числе 22 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 350 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и библиографического указателя использованной литературы, который включает 140 отечественных и 105 иностранных источников. Работа иллюстрирована 128 таблицами и 64 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.ЭЛЕКТРОННО-ЛУЧЕВАЯ ПЕГИЛЯЦИЯ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ. Не заглавными буквами.

В качестве объекта для исследований закономерностей электронно-лучевой пегиляции был выбран широко известный белок из класса цитокинов – рекомбинантный человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (рчгКСФ) и полиэтиленгликоли различной молекулярной массы. Электронно-лучевая пегиляция осуществлялась в центре электронно-лучевой обработки Института ядерной физики им. Будкера СО АН РФ г.Новосибирск. Реакция пегиляции происходила под пучком ускоренных электронов, создаваемым ускорителем ИЛУ-10, производства Института ядерной физики им. Будкера СО АН РФ. Для исследования образовавшихся в результате облучения молекулярных комплексов были использованы следующие методы: Гель-электрофорез, эксклюзионная ВЭЖХ, спектроскопия. Метод эксклюзионной ВЭЖХ хроматографии (SEC-HPLC), позволяет оценить молекулярные массы молекул веществ различной химической природы. Метод основан на принципе разделения молекул вещества в хроматографической системе, за счет их разной способности проникать в поры стационарной фазы. При этом первыми выходят из хроматографической колонки наиболее крупные молекулы способные проникать в минимальное число пор стационарной фазы. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры. При проведении анализов облученных ПЭГов в качестве подвижной фазы (элюента) была использована очищенная вода, детекцию проводили на ELS детекторе, скорость потока элюента 1мл/мин, неподвижная фаза колонка PROGEL-TSK GMPWXL с пределами фракционирования молекулярных масс от 500 до 8 млн. Да (по ПЭГу). Дополнительно испытуемые образцы анализировались электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (SDS-PAGE). Данный метод позволяет разделять белки на отдельные фракции в зависимости от их молекулярной массы. При проведении хроматографии в качестве элюента был использован 0,1М раствор хлорида натрия, закисленный уксусной кислотой до рН=4,0, детекцию проводили на проточном ВЭЖХ-спектрофотометре при =215нм, скорость потока элюента 1мл/мин в изократическом режиме при комнатной температуре, неподвижная фаза: ВЭЖХ-колонка TSK-GEL G3000SWxl. Последовательно проведены следующие исследования: исследование молекулярных взаимодействий между полиэтиленоксидами различной молекулярной массы и рчГ-КСФ, возникающих в результате облучения препаратов потоком ускоренных электронов; исследование образцов облученных растворов ПЭГов без добавления рчГ-КСФ; исследование образцов совместно облученных растворов ПЭГов с рчГ-КСФ.

2. ИССЛЕДОВАНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ  ПЕГИЛИРОВАННОГО ПОСРЕДСТВОМ ЭЛП  ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА (ПЭГ-Г-КСФ).

Комплекс ПЭГ-Г-КСФ получен посредством воздействия потока ускоренных электронов с энергией 2,5 МэВ, поглощенной дозой от 2 до 10 кГр и скоростью набора дозы 1,65 кГр/час. Факт образования принципиально нового вещества - конъюгата ПЭГ-Г-КСФ, был установлен с помощью метода SEC-HPLC-хроматографии (ВЭЖХ-гель-фильтрация), а использование SDS-ПААГ электрофореза позволило определить молекулярную массу синтезированного соединения, составляющую 90-100 кДа (при 19,6 кДа у немодифицированного Г-КСФ).

Изучение фармакокинетики и фармакодинамики ПЭГ-Г-КСФ. На данном этапе исследования были поставлены следующие задачи: 1.Оценить способность ПЭГ-Г-КСФ, вводимого внутрижелудочно, подкожно, ректально и внутривенно, детектироваться с помощью ИФА-метода; 2.Исследовать динамику содержания ПЭГ-Г-КСФ в сыворотке крови при парентеральном и пероральном введении; 3.Изучить колониестимулирующую активность сыворотки крови при парентеральном и пероральном введении ПЭГ-Г-КСФ. Были проведены 2 полностью идентичных серии экспериментов: а) эксперимент, направленный на изучение способности ПЭГ-Г-КСФ детектироваться с помощью ИФА-метода и исследованию динамики содержания Г-КСФ в сыворотке крови при парентеральном и пероральном введении. Интактные мыши: 3 мыши; б) эксперимент, направленный на изучение фармакологического профиля ПЭГ-Г-КСФ методом тестирования колониестимулирующей активности сыворотки крови. Фармакокинетику ПЭГ-Г-КСФ определяли по содержанию Г-КСФ в сыворотке крови с помощью ИФА. Кроме того, внемодельным методом с использованием пакета программ М-IND [Агафонов А.А., Пиотровский В.К., 1991]. Тестирование колониестимулирующей активности проводили микрометодом в 96-луночных планшетах [Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П., 1992].

Изучении гемостимулирующей активности препарата ПЭГ-Г-КСФ на модели цитостатической миелосупрессии. В данном разделе были поставлены следующие задачи: 1.Охарактеризовать изменения картины периферической крови и костного мозга, возникающие под действием ПЭГ-Г-КСФ при его введении различными путями, либо нейтростима, на модели угнетения гемопоэза циклофосфаном; 2.Исследовать содержание коммитированных предшественников эритро- и грануломоноцитопоэза в костном мозге мышей, получавших ПЭГ-Г-КСФ, либо нейтростим, на фоне ЦФ; 3.Изучить влияние ПЭГ-Г-КСФ в сравнении с нейтростимом на интенсивность пролиферации и созревания гемопоэтических клеток-предшественников в условиях миелосупрессии, вызванной введением ЦФ; 4.Определить изменения содержания стромальных прекурсоров в костном мозге под влиянием ПЭГ-Г-КСФ в сравнении с нейтростимом на модели угнетения гемопоэза ЦФ; 5.Оценить секреторную активность клеток различных фракций гемопоэзиндуцирующего микроокружения у мышей при введении им ПЭГ-Г-КСФ, либо нейтростима, на фоне ЦФ.

В экспериментах использовано 160 мышей-самцов линии СВА/CaLac, массой 18-20 гр. в возрасте 2-х месяцев. Миелосупрессию вызывали однократным внутрибрюшинным введением ЦФ в дозе 250 мг/кг. Непосредственно перед введением ЦФ (Циклофосфан-Лэнс, ЗАО «Верофарм», г. Москва) растворяли в стерильном физиологическом растворе.

На 2, 3, 5, 7, 10 и 13 день эксперимента в периферической крови животных всех групп общепринятыми методами определяли общее количество лейкоцитов, подсчитывали лейкоцитарные формулы. [В.В. Меньшиков, 1987]. С помощью автоматического гематологического анализатора ABACUS (Diatron, Австрия) оценивали состояние периферического звена эритрона (содержание гемоглобина, количество эритроцитов, гематокрит, средняя корпускулярная концентрация гемоглобина). Стандартным способом определяли общую клеточность костного мозга (на бедро) и его морфологический состав (по данным миелограмм) [В.В. Меньшиков, 1987]. Методом клонирования в полувязкой среде на основе метилцеллюлозы определяли содержание эритроидных (КОЕ-Э), гранулоцитомакрофагальных (КОЕ-ГМ) и стромальных (КОЕ-Ф) предшественников в костном мозге экспериментальных животных [Е.Д. Гольдберг и др., 1992]. Кроме того, изучали интенсивность пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток-предшественников. С целью оценки функциональной активности гемопоэзиндуцирующего микроокружения (ГИМ) определяли интенсивность секреции факторов, составляющих колониестимулирующую (КСА), эритропоэтическую (ЭПА) и фибробластстимулирующую (ФСА) активности, элементами.

Изучение токсического действия в остром эксперименте при однократном введении. Целью данного исследования явилось определение переносимых, токсических и летальных доз предлагаемого средства при различных путях его введения с использованием метода Литчфилда и Уилкоксона, установление причин наступления гибели животных в течение 14 дней наблюдения, изучение влияния его на общее состояние, некоторые функциональные и морфологические показатели. Эксперименты поставлены на половозрелых белых неинбредных мышах (18 животных с исходной масса тела 25-35 г) и крысах (18 животных с исходной массой тела 250-350 г. Препарат вводили мышам и крысам однократно внутривенно, внутрижелудочно и подкожно. А доза?

Изучение общетоксического действия в течение 6 месяцев (хроническая токсичность). Целью хронического токсикологического исследования является характеристика степени повреждающего действия ПЭГ-Г-КСФ при многократном введении крысам и кроликам, выявление наиболее чувствительных органов и систем организма, а также степени обратимости вызываемых испытуемым средством повреждений. Изучение хронической токсичности проведено на 120 крысах (самцах и самках) и 12 кроликах. Изучалось влияние ПЭГ-Г-КСФ при пероральном введении препарата крысам в трех дозах (50, 250 и 500 мкг/кг) и кроликам в двух дозах (50 и 250 мкг/кг) в течение трех месяцев. Так как получить значение LD50 для ПЭГ-Г-КСФ не было возможным, за минимальную дозу была выбрана терапевтическая доза, полученная в экспериментальном исследовании на мышах – 100 мкг/кг, третья – рассчитывается с учетом доз, полученных в остром эксперименте, и превосходит первую дозу в 10 раз. Вторая доза – промежуточная. Контролем служили животные, получавшие в эквиобъеме большой дозе 2 % раствор ПЭГа. Величина минимальной дозы для крыс была получена после соответствующего перерасчета дозы для мышей по Freireich, 1966.

3.ИССЛЕДОВАНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПЕГИЛИРОВАННОГО ПОСРЕДСТВОМ ЭЛП ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА-ПРОТЕИНАЗЫ (ПЭГ-П).

Физико-химические свойства ПЭГ-П. Электронно-лучевая пегиляция протеиназы осуществлялась потоком ускоренных электронов с энергией не менее 2,0 МэВ до поглощенной дозы 1,0 Мрад (Патент РФ № 2270861 «Способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата протеаз»). В качестве стандарта при проведении химической аналитики использовался ферментный продукт - Декозим-NP представляющий собой фермент (из нейтральных бактериальных протеаз) для гидролизации белка, который применяется в различных отраслях промышленности, таких как производство выпечки, спиртных напитков (в т. ч. в пивоварении) и кормовых добавок. Исследование проводилось методом ВЭЖХ-МС/МС в режиме наноэлектроспрея. Сущность метода состоит в предварительном трипсинолизе анализируемых белков, ОФ-ВЭЖХ разделении полученных пептидов, их последующем анализе по молекулярным массам (пептидный фингерпринт) и анализе полученных данных с помощью программного обеспечения MASCOT. В результате был получен белковый сиквенс протеиназы.

Исследование тромболитической активности IN VITRO. Исследование фибринолитического действия ПЭГ-П заключалось в определении характера разрушения молекул фибрина: является ли ПЭГ-П активатором плазминогена или обладает прямым фибринолитическим эффектом. Использовались следующие материалы и оборудование: Хромогенный субстрат For-Ala-Phe-Lys-pNA.HBr в составе набора реагентов «ХромоТех-Плазминоген», производитель ООО фирма «Технология-Стандарт», серия Б31227; Стрептокиназа, 5000 МЕ/мл, в составе набора реагентов «ХромоТех-Плазминоген», производитель ООО фирма «Технология-Стандарт», серия Б40323 (необходима для контрольного исследования); ПЭГ-П, активностью 5,10 и 20 Ед/мл дистиллированной воды; Трис-HCI буфер 0,1М, Ph=7,4 производитель ООО фирма «Технология-Стандарт», серия Б40412; Референтная нормальная плазма (РНП-плазма), производитель ООО фир­ма «Технология-Стандарт» (смесь образцов плазмы от 40 здоровых доно­ров), серия Б40206; Фотометр RA-50, производитель фирма Bayer. Измерения проводились при длине волны 405 нм; Эуглобулины, приготовленные из пулированной плазмы крови практически здоровых людей; Тромбин человека 50 NIH ед/мл, производитель ООО фирма «Техно­логия-Стандарт», серия Б41333; Термостат для исследования гемокоагуляции (ТПС); Фибрин-мономер, лиофилизированный. Компонент набора «ТехФактор ХШ-тест», производитель ООО фирма «Технология-Стандарт», серия Б271322.

Исследование фибринолитической активности ПЭГ-П. Была проведена предварительная полуколичественная (без калибровки по стандарту) сравнительная оценка фибринолитической активности ПЭГ-П. Исследование фибринолитической активности ПЭГ-П проводилось по методу Аструпа. Оценка эффектов препарата ПЭГ-П также была выполнена на пуле плаз­мы, полученной при смешивании равных объемов образцов бедной тромбоцитами плазмы стабилизированной цитратом венозной крови 12 практически здоровых людей в возрасте от 19 до 35 лет. Препарат растворяли дистиллированной водой до концентрации 5 Ед/мл, 10 Ед/мл, 20 Ед/мл. Фибринолитическое действие ПЭГ-П исследовали в сле­дующих тест-системах: 1.по оценке гидролиза хромогенного субстрата For-Ala-Phe-Lys-pNA.HBr, специфичного к действию плазмина (по патенту РФ № 2121690,1998); 2. по определению времени лизиса эуглобулинов плазмы крови (по Kowarzyk etal.,1950); 3. по определению времени лизиса сгустка нестабилизированного фибрина, полученного из очищенного фибрин-мономера.

Исследование антиагрегантной активности ПЭГ-П. Препарат во флаконах всех изучаемых серий растворяли при комнатной тем­пературе (+18...+25°С) путем добавления дистиллированной воды до концентрации 5 Ед/мл, 10 Ед/мл и 20 Ед/мл. Оценка эффектов препарата ПЭГ-П была выполнена на пуле плазмы, полученной при смешивании равных объемов образцов бедной тромбоцитами плазмы стабилизированной цитратом венозной крови 20 практически здоровых людей в возрасте от 18 до 36 лет.

Электрокоагулографическое исследование цельной крови. Графическую регистрацию процесса свертывания цельной крови проводили методом низкочастотной вибрационной пьезоэлектрической гемокоагулографией (НПГК) (Патент на изобретение МПК6 G01 N33/48 от 6 марта 1995 г. «Способ оценки функционального состояния системы гемостаза». На рисунке 2 представлен график регистрации НПГК с временными и амплитудными характеристиками, используемыми для расчета коэффициентов.

Исследования фармакологических свойств IN VIVO.

Исследование специфической фибринолитической активности препарата ПЭГ-П. Эксперименты проведены на 20 крысах-самцах линии Вистар массой 220-240 г. ПЭГ-П вводили в дозе 10 ПЕ/кг внутривенно и 70 ПЕ/кг внутрибрюшинно. Фибринолитическую активность оценивали методом определения спонтанного эуглобулинового фибринолиза с использованием набора “Фибринолиз-тест” фирмы “Технология стандарт”.

Исследование гемореологической активности. Исследование гемореологической активности ПЭГ-П проведено на 18 крысах-самцах линии Вистар массой 220-240 г. ПЭГ-П вводили в дозе 10 ПЕ/кг внутривенно и 70 ПЕ/кг внутрибрюшинно. Вязкость крови и плазмы измеряли на ротационном вискозиметре АКР-2: кровь в диапазоне скоростей сдвига от 3 с-1 до 300 с-1, плазму на 300 с-1. Содержание фибриногена в плазме крови определяли на гемокоагулометре "Cormay KG-4". Гематокрит определяли методом центрифугирования в стеклянных капиллярах. Агрегацию эритроцитов исследовали силлектометрическим методом на модифицированном микроколориметре МКМФ-1 с регистрацией на графопостроителе Н306.

Исследование тромболитической активности ПЭГ-П при профилактическом и лечебном введении. Исследование тромболитической активности ПЭГ-П при профилактическом введении проведено на 19 крысах-самцах линии Вистар массой 220-240 г. Кровоток в сонных артериях измеряли с помощью электромагнитного расходомера крови MFV-1100 и MFV-2100 (Nihon Kohden, Япония) с графической регистрацией на самописце КСП-4. Моделирование тромбоза проводили с использованием железа (II) хлорида: ватный тампон массой 1,5 мг смачивали до полного пропитывания в 10% растворе хлорида железа и накладывали на отпрепарированную общую сонную артерию. Окружающие ткани от тампона изолировали прокладкой из полиэтиленовой пленки. Через 15 мин ватный тампон убирали и трехкратно промывали операционное поле физиологическим раствором. Кровоток регистрировали в течение 90 минут от момента аппликации хлорида железа. Через 24 часа у крыс определяли наличие кровотока по общим сонным артериям. После эвтаназии животных передозировкой эфирного наркоза, вырезали сегменты правой и левой общих сонных артерий равной длины. Промывали просвет сосуда от наличия крови, просушивали марлевой салфеткой и взвешивали. Массу тромба определяли по разнице масс сегментов ипсилатеральной и контрлатеральной артерий.

Исследование тромболитической активности ПЭГ-П при лечебном введении проведено на 20 крысах-самцах линии Вистар массой 220-240 г. Кровоток в сонных артериях измеряли с помощью электромагнитного расходомера крови MFV-1100 и MFV-2100 (Nihon Kohden, Япония. Системное артериальное давление (САД) измеряли прямым методомМоделирование тромбоза проводили с использованием железа(II) хлорида. ПЭГ-П вводили через 5 мин после удаления хлорида железа в дозе 150 ЕД на крысу внутрибрюшинно (1,5 мл) и 10 ЕД на крысу внутривенно инфузионно в течение 10 мин (0,1 мл тромбовазима, разведенного в 0,5 мл физиологического раствора). В контроле животным вводили физиологический раствор из расчета 1,5 мл на крысу внутрибрюшинно и 0,6 мл на крысу внутривенно инфузионно в течение 10 мин.

Исследование тромболитической активности энтеральной формы ПЭГ-П при лечебно-профилактическом введении. Исследование тромболитической активности ПЭГ-П проведено на 20 крысах-самцах линии Вистар массой 250-300 г. Артериальный тромбоз моделировали с использованием FeCl2. Кровоток регистрировали в течение 40 мин от момента аппликации хлорида железа. Через 48 ч крыс повторно наркотизировали и определяли наличие кровотока по общим сонным артериям. После эвтаназии животных передозировкой наркоза, вырезали сегмент левой общей сонной артерии, извлекали тромб, промывали его в физиологическом растворе, удаляли избыток влаги фильтровальной бумагой, высушивали до постоянной массы при температуре 60 0С и взвешивали на аналитических весах. ПЭГ-П вводили внутрижелудочно в дозе 1000 ЕД/кг. Первое введение проводили за 4 ч до аппликации FeCl2, второе - через 2 ч после. В последующий период ПЭГ-П вводили дважды в сутки. Животные контрольной группы получали эквиобъемное количество дистиллированной воды.

Исследование антиагрегантной активности. Исследование антиагрегантной активности ПЭГ-П проведено на 23 крысах-самцах линии Вистар массой 220-240 г. ПЭГ-П вводили в дозе 10 ПЕ/кг в бедренную вену и 70 ПЕ/кг внутрибрюшинно. Кровь для исследования забирали через 1 час после введения ПЭГ-П методом катетеризирования общей сонной артерии. Для получения богатой тромбоцитами плазмы (БТП) кровь центрифугировали при 1000 об./мин в течение 10 мин на центрифуге РС-6. Бедную тромбоцитами плазму получали центрифугированием супернатанта при 3000 об./мин в течение 20 мин. Агрегацию тромбоцитов, вызванную индуктором АДФ в концентрации 1.10-6 М, измеряли на анализаторе агрегации тромбоцитов АТ-02, агрегатограммы регистрировали на самописце Recorder 2210.

Исследование фармакокинетики ПЭГ-П. Для исследования фармакокинетики ПЭГ-П использовали метод определения кислоторастворимых продуктов протеолиза. В экспериментах использовали "Azocasein" производства ISN Pharmaceuticals. Кислоторастворимые продукты гидролиза определяли по поглощению света при длине волны 350 нМ на спектрофотометре "Hitachi-557". После свертывания кровь центрифугировали при 2700 об./мин в течение 20 мин (центрифуга Элекон ЦЛМН Р10-01). К 1 мл полученной сыворотки добавляли 2,5 мл 0,2% раствора азоказеина в 0,05 М натрий-фосфатном буфере с pH 8,2. Пробирки инкубировали при 45 0С в течение 2 часов на водяной бане, затем прибавляли по 2,5 мл 10% трихлоруксусной кислоты и оставляли при температуре инкубации на 20 минут для осаждения непрореагировавшего субстрата. Затем содержимое пробирок фильтровали через бумажные фильтры "синяя лента" и определяли поглощение при 350 нМ, используя в качестве сравнения контрольную пробу, содержащую сыворотку крови крыс, не получавших препарат. После измерения экстинции по калибровочной кривой определяли содержание ПЭГ-П в сыворотке. Интегральные модельно-независимые параметры фармакокинетики ПЭГ-П рассчитывали методом статистических моментов по фармакокинетической кривой, построенной по средним концентрациям препарата в крови крыс на каждый временной промежуток. Для расчета биодоступности препарата использовали фармакокинетические параметры ПЭГ-П при внутривенном введении.

Исследование фармакокинетики ПЭГ-П при энтеральном введении. Эксперименты проведены на 70 беспородных крысах-самцах массой 350-420 г. ПЭГ-П вводили внутрижелудочно в дозе 2250 ЕД/кг. Пробы крови забирали из сонной артерии крыс (под эфирным наркозом) через тефлоновый катетер через 1, 2, 3, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7 и 8 ч после введения ПЭГ-П.

Исследование фармакокинетики ПЭГ- при внутривенном введении. Эксперименты проведены на 36 беспородных крысах-самцах массой 240-280 г. ПЭГ-П вводили в хвостовую вену в дозе 30 ЕД/кг. Кровь для получения сыворотки забирали после декапитации животных на 1, 5, 10, 15 и 30 минутах.

Исследование параметров токсичности при парентеральном введении.

Изучение токсичности ПЭГ-П при однократном введении лабораторным животным. В эксперименте использованы половозрелые неинбредные мыши, исходной массой 20 - 30 г (42 животных), и крысы (17 самцов и 17 самок), исходной массой 200 - 250 г, полученные из вивария “Рассвет” (г. Томск). Наблюдение за животными осуществляли в течение 2 недель. Следили за поведением, внешним видом, двигательной активностью, реакцией животных на внешние раздражители, общей массой (до и через 14 дней после введения). Мышам (по 4 - 5 и на дозу) препарат вводили внутрибрюшинно в дозе 0,9 мл (18 ЕД или 135,5 мг/ на 20 г массы тела мыши или 6750 мг/кг) двукратно через 3 ч (13500 мг/кг) и трехкратно через 2 ч (20250 мг/кг), а внутривенно в течение 10 – 20 с однократно – в дозах 0,3; 0,4 и 0,5 мл (6, 8, 10 ЕД или 37,5; 50,0 и 62,5 мг/ на 20 г массы тела мыши или 1875, 2500 и 3125 мг/кг). Крысам (по 3 – 5 и на дозу) препарат вводили внутрибрюшинно в дозе 7500 мг/кг (100 ЕД на 100 г общей массы крысы) в максимально допустимом объеме (5 мл) и внутривенно в течение 10 – 20 с в дозе 1250, 2500 и 3750 мг/кг (20, 40 и 60 ЕД на 100 г общей массы крысы) в максимально допустимом объеме (2 мл).

Изучение токсичности ПЭГ-П при многократном  введении (хроническая токсичность). В эксперименте использовано 82 крысы (41 самец и 41 самка). ПЭГ-П животным опытных групп вводили внутрибрюшинно ежедневно в течение 14 дней. Перед введением содержимое одного флакона растворяли в 10 – 12 мл физиологического раствора. Контрольные крысы получали 1,5 мл на 100 г их массы физиологический раствор. О токсичности ПЭГ-П судили по общему состоянию, динамике общей массы при еженедельном взвешивании, картине периферической крови, костного мозга, функции печени, почек, нервной системы, сердца (ЭКГ, АД), а также данным морфологического исследования внутренних органов и их массы (головной мозг, сердце, легкое, печень, тимус, селезенка, лимфатические узлы, желудочно-кишечный тракт, надпочечники, половые железы, поджелудочная и щитовидная железа). Исследования проводили после окончания 14-дневного введения препарата, а также через 2 недели после его отмены.

Исследование параметров токсичности при энтеральном введении. Эксперименты поставлены на половозрелых неинбредных мышах и крысах, а также кроликах. Исследования проведены в соответствии с методическими указаниями по изучению общетоксического действия фармакологических веществ («Руководство по экспериментальному /доклиническому/ изучению новых фармакологических веществ», под ред Р.У.Хабриева.).

Изучение токсичности однократном введении лабораторным животным. В эксперименте ПЭГ-П растворяли в физиологическом растворе и вводили однократно внутрижелудочно с помощью металлического зонда мышам (15 самцов и 15 самок), исходной массой 23–36 г, в дозах 5,0, 10,0 и 20,0 г/кг (соответственно 3500, 7000 и 14000 ЕД/кг), и крысам (5 самцов и 5 самок), исходной массой 140–215 г, в дозе 5,0 г/кг (3500 ЕД/кг). Наблюдение за животными осуществляли в течение 2 недель. Следили за поведением, внешним видом, двигательной активностью, реакцией животных на внешние раздражители, общей массой (до и через 14 дней после введения).

Изучение токсичности ПЭГ-П, таблетки при многократном введении (хроническая токсичность). Результаты исследования на крысах. В эксперименте использовано 80 крыс (40 самцов и 40 самок). Выбранные дозы приблизительно в 4, 20 и 40 раз превышали суточную дозу на кг массы для человека. ПЭГ-П животным опытных групп вводили внутрижелудочно с помощью металлического зонда ежедневно в течение 30 дней. О токсичности испытуемого средства судили по общему состоянию, динамике общей массы при еженедельном взвешивании, картине периферической крови, костного мозга, функции печени, почек, нервной системы, сердца (ЭКГ), а также данным морфологического исследования внутренних органов и их массы (головной мозг, сердце, легкие, печень, тимус, селезенка, лимфатические узлы, желудочно-кишечный тракт, почки, надпочечники, половые железы, поджелудочная и щитовидная железа). Исследования проводили после окончания 30-дневного введения препарата, а также через 2 недели после его отмены. Результаты исследования на кроликах. Изучение месячной токсичности ПЭГ-П проведено на 15 кроликах (7 самцов и 8 самок), исходной массой 1,2–2,0 кг (возраст – 2–3 мес). Препарат животные получали 7 раз в неделю в течение 30 дней внутрь с пищей (измельченная морковь): кролики I группы (2 самца и 3 самки) получали 0,5 таблетки препарата (150 ЕД), II группы (2 самца и 3 самки) – одну таблетку (300 ЕД), Контроль (3 самца и 2 самки), интактные животные, - только морковь. Велось наблюдение за общим состоянием животных, взвешивание через 2 недели. Через 30 дней опыта у животных брали кровь из краевой вены уха для определения параметров общего анализа крови и биохимических показателей, а после эфтаназии путем введения внутривенно насыщенного раствора хлористого калия в дозе 1 мл/кг массы животного (гибель животных наступала практически мгновенно от остановки сердца) проводилось вскрытие животных, после чего забор мочи для биохимического исследования из мочевого пузыря и внутренних органов для их макроскопического и микроскопического изучения

Исследование местнораздражающего действия ПЭГ-П. О местно-раздражающем действии ПЭГ-П у крыс, получавших препарат внутрижелудочно, судили по макро- и микроскопическому состоянию слизистой оболочки желудка.

Клинические исследования инъекционной формы. Согласно разрешению № 244 от 22 декабря 2003 года Департамента государственного контроля лекарственных средств, изделий медицинского назначения МЗ РФ на проведение клинических испытаний, исследования I и II-й фазы проводились в четырех клинических центрах: ГУ НИИ кардиологии ТНЦ СО РАН, г. Томск; МУЗ Городская клиническая больница № 1, Новосибирск; Центральная клиническая больница СО РАН, Новосибирск; Городская клиническая больница № 34. Цель исследования изучить безопасность и эффективность терапии ПЭГ-П у больных острым инфарктом миокарда в сравнении с терапией стрептокиназой.

Задачи исследования в 1-й фазе: 1)изучить безопасность лекарственного средства ПЭГ-П; 2)оценить частоту и сроки достижения реперфузии инфаркт-связанной коронарной артерии; 3)определить частоту 30-дневной летальности, рецидивов инфаркта миокарда; 4)определить частоту и выраженность гипотензивной реакции на фоне введения тромболитического препарата; 5)установить частоту и выраженность геморрагических осложнений; 6)оценить влияние изучаемых препаратов на показатели гемостаза. Способ введения: препарат вводится в дозах 10-20 ЕД на кг массы тела в разведении 1 флакон лиофилизата в 200-400 мл физиологического раствора. Введение препарата осуществляется внутривенно капельно со скоростью не более, чем 40 ЕД в минуту. Препарат вводится 1-3 раза в первые сутки и 1-2 раза в течение последующих 2-4 суток.

Задачи во 2 фазе: 1)на основании данных ЭКГ оценить частоту и сроки достижения реперфузии инфаркт-связанной коронарной артерии и сравнить с результатами при лечении стрептокиназой; 2)определить частоту 30-дневной летальности, рецидивов инфаркта миокарда и постинфарктной стенокардии (частоту кардиальных событий) при лечении ПЭГ-П и стрептокиназой; 3)подобрать наиболее эффективные дозы ПЭГ-П для получения тромболитического эффекта. Способ введения. Внутривенное капельное введение ПЭГ-П в течение 60 мин в дозе 2000 Ед со скоростью не более 40 Ед/мин. После ударной дозы вводится поддерживающая доза ПЭГ-П 2000 ЕД со скоростью 100 Ед/час через перфузомат в течение суток. Последующие введения ПЭГ-П осуществляются во 2-е и 3-и сутки со скоростью 100 Ед/час через перфузомат в дозе 2000 Ед/сутки. В группу наблюдения был включен 61 больной с острым инфарктом миокарда. Этим пациентам для реперфузии ИСКА ПЭГ-П вводился сразу после рандомизации, а затем на 2-е и 3-и сутки наблюдения с целью профилактики реинфарктов. В группу сравнения было включено 38 человек с острым инфарктом миокарда. Пациентам из группы контроля тромболитическую терапию также начинали сразу после рандомизации. Пациентам вводилась стрептокиназа в дозе 750 тыс. или 1500 тыс. ЕД.

Клиническое исследование 3 фазы проводилось в два этапа. IIIA фаза проводилось по разрешению № 256 от 12 июля 2005 года Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития МЗ и Социального развития Российской Федерации в период с 12 июля 2005 года по 1 марта 2006 года. IIIБ фаза клинических исследований была проведена на основании разрешения №145 от 6 апреля 2007 года и разрешения на продление от 1 октября 2008 года в период с 6 марта 2007 года по 31 января 2009 года. Результаты исследований были объединены для анализа. Всего в исследовании приняли участие 118 больных острым инфарктом миокарда. Цель исследования изучить эффективность и безопасность терапии ПЭГ-П у больных острым инфарктом миокарда в сравнении с терапией Стрептокиназой. Задачи исследования: 1)оценить частоту и сроки достижения реперфузии инфаркт-связанной коронарной артерии; 2)оценить частоту кардиальных событий (летальности в течение 30 дней, нефатальных реинфарктов и нестабильной стенокардии); 3)оценить частоту и выраженность гипотензивной реакции на фоне введения тромболитического препарата; 4)оценить частоту и выраженность геморрагических осложнений; 5)оценить влияние изучаемых препаратов на показатели гемостаза; 6)оценить восстановление гемодинамической функции миокарда. Вид исследования: открытое рандомизированное с использованием метода параллельных групп. Способ и дозы введения: внутривенное капельное введение ПЭГ-П в течение 60 мин в дозе 2000 ЕД со скоростью не более 40 ЕД/мин. После ударной дозы вводилась поддерживающая доза ПЭГ-П 2000 ЕД со скоростью 100 ЕД/час через перфузомат в течение суток. Для участия в исследовании отбирались пациенты мужского и женского пола в возрасте от 40 до 75 лет, у которых в течение 6 часов развились признаки инфаркта миокарда.

Клинические исследования энтеральной формы ПЭГ-П.

Клинические исследования безопасности и эффективности при хронической венозной недостаточности. 1 и 2 фазы проводились по разрешению № 257 от 12 июля 2005 года Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Клинические исследования проводились по Правилам GCP в соответствии с действующими нормативными требованиями (ОСТ 42-511-99 от 01.01.99 г. Клинические центры: ГУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирск; МУЗ Городская клиническая больница № 12, Новосибирск; Некоммерческая организация, фонд развития и оказания специализированной медицинской помощи «Медсанчасть-168», Новосибирск. Цель исследования изучить эффективность и безопасность терапии ПЭГ-П у больных хронической венозной недостаточностью. Задачи исследования: 1)оценить изменения степени венозной недостаточности при 14-дневном курсе лечения ПЭГ-П по данным объективного и клинического обследования в день поступления и на 15-й день после начала лечения; 2)оценить частоту и выраженность геморрагических осложнений; 3)изучить влияние ПЭГ-П на показатели гемостаза. Для участия в исследовании отбирались пациенты 40-75 лет мужского и женского пола с хронической венозной недостаточностью, (III-VI степень по международной классификации СЕАР9) с отёками, экземой, гиперпигментацией, трофическими нарушениями кожи. В группу наблюдения (ПЭГ-П) было включено 33 больных хронической венозной недостаточностью. Эти пациенты принимали ПЭГ-П сразу после рандомизации. В группе контроля (29 пациентов) в качестве препарата сравнения был использован Троксевазин в дозе 600 мг в сутки. Способ введения: ПЭГ-П вводился per os, продолжительность лечения 14 дней. Максимальная разовая доза – 8 таблеток. Максимальная суточная доза 10 таблеток. Максимальная курсовая доза не превышала 28 000 ЕД. Эффективность терапии оценивалась по динамике следующих показателей: окружность голени, размеры трофической язвы, показатели реолимфовазографии и лазерной доплеровской флоуметрии, отражающие характер вено- и лимфооттока, а также балльной оценки по клинической шкале СЕАР. Для части пациентов факультативно была проведена лимфосцинтиграфия.

3 фаза проводились по разрешению № 146 от «06» апреля 2007 года Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Клиническое исследование проводились по Правилам GCP в соответствии с действующими нормативными требованиями (ОСТ 42-511-99 от 01.01.99 г., Приказ Минздрава РФ №266 от 19.06.2003 г. Клинические центры: ГУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирск; ФГУ «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения им. ак. Е.Н.Мешалкина Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», Новосибирск; Некоммерческая организация, фонд развития и оказания специализированной медицинской помощи «Медсанчасть-168», Новосибирск. Цель исследования изучить эффективность и безопасность терапии ПЭГ-П у больных хронической венозной недостаточностью. Задачи исследования: 1)оценить изменения степени венозной недостаточности при 20-дневном курсе лечения ПЭГ-П по данным объективного и клинического обследования в день поступления, на 10-12 день и на 20 день после начала лечения; 2)оценить частоту и выраженность геморрагических осложнений; 3)изучить влияние ПЭГ-П на показатели гемостаза. Вид исследования – открытое рандомизированное с использованием метода параллельных групп. В исследовании приняли участие 57 больных хронической венозной недостаточностью. Рандомизация обеспечивалась методом случайных чисел. В группу наблюдения (ПЭГ-П) было включено 40 больных хронической венозной недостаточностью. В группе контроля (17 пациентов) в качестве препарата сравнения был использован Троксевазин в дозе 600 мг в сутки. Анализ побочных эффектов и осложнений проведен у всех больных, которые принимали ПЭГ-П и Троксевазин. Способ введения: ПЭГ-П вводился per os. Продолжительность лечения 20 дней. Максимальная разовая доза – 8 таблеток. Максимальная курсовая доза не превышала 32000 ЕД. Эффективность терапии оценивалась по динамике следующих показателей: окружность голени, размеры трофической язвы, показатели реолимфовазографии и лазерной доплеровской флоуметрии, отражающие характер вено- и лимфооттока, а также балльной оценки по клинической шкале СЕАР. Для части пациентов факультативно была проведена лимфосцинтиграфия.

Клиническое исследование для определения эффективности и безопасности применения препарата ПЭГ-П у пациенток с хронической венозной недостаточностью на фоне применения гормональной заместительной терапии и гормональных контрацептивов. Исследование проведено в МУЗ «Муниципальный центр планирования семьи и репродукции», Новосибирск. В исследовании приняли участие 13 пациенток, принимающих гормональную заместительную терапию и гормональные оральные контрацептивы, у которых развились признаки хронической венозной недостаточности. Вид исследования: Открытое, несравнительное клиническое исследование. Цель исследования: изучить эффективность и безопасность терапии ПЭГ-П у женщин с хронической венозной недостаточностью на фоне применения гормональной заместительной терапии и гормональных контрацептивов. Задачи исследования: 1)оценить эффект курсовой дозы ПЭГ-П на выраженность симптомов ХВН; 2)оценить показатели гемостаза у данной группы после проведения терапии ПЭГ-П; 3)оценить характер и выраженность нежелательных явлений или нежелательных реакций, если они наступят в результате приема ПЭГ-П; 4)в зависимости от полученных данных об эффективности и безопасности расширить позиционирование препарата. Способ применения: ПЭГ-П принимается per os. Продолжительность лечения – 12 дней. Препарат принимается по 4 таблетки за 1 час до еды 2 раза в день. Суточная доза – 8 таблеток (1600 Ед). Максимальная суточная доза 2000 ЕД. Максимальная курсовая доза не должна превышать 30000 ЕД. Методы и порядок контроля исследуемых признаков: оценка по клинической шкале СЕАР до начала исследования и на 12 -14 сутки; оценка толерантности к нагрузкам по бальной шкале при ХВН до начала исследования и на 12 – 14 сутки; оценка показателей гемостаза, отражающие процессы тромбообразования до начала лечения и на 12 – 14 сутки; данные о безопасности на момент окончания курса терапии ПЭГ-П. Исследования гемостаза проводились с помощью современных стандартизированных коагулологических наборов на коагулометре «Sysmex CA-50» (Япония), лазерном анализаторе микрочастиц «Ласка-БИО» (НПФ «Люмекс», Санкт-Петербург, Россия).

Клиническое исследование по эффективности и безопасности применения ПЭГ-П у пациентов с цереброваскулярными расстройствами и тромбозом венозной системы головного мозга. Исследование проводилось в условиях стационара на базе МУЗ ГМКБ №1 г.Новосибирска. Длительность наблюдения за пациентом осуществлялась в течение 12 дней. В группу наблюдения включено 13 пациентов с цереброваскулярными расстройствами и выявленными на компьютерной томографии тромбозом венозной системы головного мозга, протекающими на фоне хронической венозной недостаточности. Цель исследования оценить эффективность и безопасность препарата ПЭГ-П у больных с цереброваскулярными нарушениями вследствие тромбоза венозной системы головного мозга. Задачи исследования: оценить терапевтические возможности препарата по следующим критериям эффективности: динамика неврологического статуса; динамика показателей томографического исследования: структурные изменения тромботических масс, степень восстановления кровотока; динамика хронической венозной недостаточности по бальной шкале СЕАР; динамика показателей гемостаза (АЧТВ, ПТВ, ТВ, ФГ, РФМК, Д-димер, антитромбин III, XIIa- зависимый фибринолиз, плазминоген).


СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1.ЭЛЕКТРОННО-ЛУЧЕВАЯ ПЕГИЛЯЦИЯ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ.

Исследование образцов облученных растворов ПЭГов без добавления рчГ-КСФ. Свойства растворов ПЭГ во многом зависят от молекулярной массы. Очень важна так называемая «точка 3400». Это экспериментально найденное значение молекулярной массы ПЭГ, при которой происходят резкие изменения свойствах макромолекул, их поведения в растворах. В нашем случае меняется механизм воздействия радиационного облучения на молекулу ПЭГ, так как значение 3400 Да является минимальным размером цепи ПЭГ, необходимым для кооперативного перехода в системе полимер – растворитель. Следствием неоднородности свойств ПЭГ может стать различие в механизмах взаимодействия молекул ПЭГ с молекулами белка в водных растворах при облучении. Для низкомолекулярных ПЭГ возможно присоединение только по концевой группе полимера, когда как для высокомолекулярных ПЭГ данное взаимодействие граничит с физическим включением в гель и образованием более сложных структур при помощи водородных связей.

При облучении ПЭГа одновременно проходят два процесса: деструкция полимера в результате которой происходит образование карбонильных групп и сшивание ПЭГа, что приводит к увеличению мол массы ПЭГа. Так как ПЭГ относится к преимущественно сшивающимся полимерам, то процесс сшивки идет намного интенсивней, чем процесс деструкции, что и приводит к увеличению молекулярной массы и в конечном итоге гелированию. В результате проведённых экспериментов установлено, что облучение водных растворов ПЭГа ускоренными электронами в независимости от молекулярной массы полимера приводит к увеличению молекулярной массы, причем эффект более выражен у высокомолекулярных ПЭГов с начальной низкой концентрацией. Облучение ПЭГов приводит к дозозависимому накоплению карбонильных группировок. После облучения у высокомолекулярных ПЭГов наблюдается эффект перехода в состояние предгелирования (образование ассоциатов, обладающих сверхвысокими молекулярными массами), что может быть обусловлено процессом кросслинкинга, инициированного облучением. В растворах низкомолекулярных ПЭгов протекают процессы связывания между отдельными короткими цепями полимера по радикальному механизму. Облучение ПЭГов свободными электронами инициирует переход от линейной структуры к сетчатой вне зависимости от молекулярной массы облучаемого полимера.

Исследование образцов совместно облученных растворов ПЭГов с рчГ-КСФ.

Рисунок 1. Хроматография субстанции рчГ-КСФ. Рисунок 2. Хроматографии субстанции рчГ-КСФ с 5% ПЭГ400 до и после облучения в дозе 1Мрад.
Рисунок 3. Хроматографии субстанции рчГ-КСФ с 5% ПЭГ1500 до и после облучения в дозе 1Мрад Рисунок 5. Хроматографии субстанции рчГ-КСФ с 0,18% ПЭГ10000 до и после облучения в дозе 2Мрад. Рисунок 4. Хроматографии субстанции рчГ-КСФ с 5% ПЭГ1500 до и после облучения в дозе 2 МРад Рисунок 6. Хроматографии субстанции рчГ-КСФ с 0,36% ПЭГ20000 до и после облучения в дозе 0,5Мрад.

Как видно из представленных хроматограмм в результате облучения ускоренными электронами субстанции Г-КСФ с различными ПЭГами наблюдается образование белок-ПЭГ комплексов во всех исследуемых пробах с той или иной степенью конъюгации, доказательством чего служит сокращение времени выхода пиков облученных образцов по сравнению с временем выхода исходных образцов.

Для подтверждения включения Г-КСФ в образующиеся в результате облучения с ПЭГом комплексы, был проведен электрофорез всех исследуемых образцов в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, с последующим окрашиванием гелевой пластины специфичным белковым красителем Сoomassie G 250.Результаты электрофореза подтверждают образование в исследуемых образцах комплекса ПЭГ-Г-КСФ (наличие на электрофореграммах зон, расположенных выше полосы исходной субстанции рчГ-КСФ), причем это образование обусловлено исключительно воздействием потока ускоренных электронов, поскольку образцы, содержащие Г-КСФ и ПЭГи до облучения идентичны исходной субстанции. В образовавшиеся комплексы достоверно включена белковая составляющая, что доказывается окрашиванием их специфичным белковым красителем Сoomassie G 250. На основании результатов электрофореза также можно предположить ковалентный характер связей, возникающий между Г-КСФ и молекулами ПЭГов, поскольку предварительная пробоподготовка образцов, состоящая из добавления денатураторов и кипячения, разрушает неспецифические межмолекулярные взаимодействия. В тоже время следует отметить, что прочность образовавшейся связи зависит от дозы облучения, что наглядно продемонстрировали образцы Г-КСФ с ПЭГ20000, облученные в низких дозах. На электрофорезе данных образцов наряду с зонами ПЭГ-Г-КСФ, наблюдаются единичные белковые полосы соответствующие исходному Г-КСФ, причем в образце, облученном в дозе 0,25Мрад, не связавшийся с ПЭГом остаточный белок, детектируется и на хроматограмме, что говорит о недостаточности выбранной дозы. В случае с образцами ПЭГ-Г-КСФ20000 0,5Мрад и 0,75Мрад хроматографический анализ не выявил свободного Г-КСФ, в то время как электрофорез этих же образцов зафиксировал наличие несвязанного белка. Исходя из утверждения того, что чувствительность хроматографии и электрофореза сопоставима, можно заключить, что происходит частичное высвобождение Г-КСФ из комплекса ПЭГ-Г-КСФ в процессе пробоподготовки и проведения электрофореза. Это позволяет сделать заключение о том, что дозы в 0,5Мрад и 0,75Мрад в выбранных соотношениях концентрации белка и ПЭГ20000 не обеспечивают достаточно прочной связи, как это наблюдалось в случае с образцами ПЭГ-Г-КСФ 10000. Следует отметить, что именно в образцах с ПЭГ10000, наблюдается наиболее полное включение белка в образующиеся ассоциаты (вследствие индуцированного ускоренными электронами кросслинкинга), в то время как во всех образцах с ПЭГ1500 наряду с ПЭГ-Г-КСФ детектируется несвязавшийся мономер рчГ-ГКСФ. Результаты электрофореза также выявили зависимость между молекулярной массой образующихся ПЭГ-Г-КСФ и дозой облучения. Наиболее выражено этот эффект проявился при анализе образцов с низкомолекулярными ПЭГ400 и ПЭГ1500, у которых наблюдалось увеличение диапазона молекулярной массы ПЭГ-Г-КСФ, в зависимости от дозы облучения. Для образцов с высокомолекулярными ПЭГами, подобной картины получить не удалось поскольку, при выбранных концентрациях и дозировках облучения, происходил кросслинкинг, с включенными в него ассоциатами ПЭГ-Г-КСФ. Таким образом, на основании проведенных исследований очевидно, что: 1)облучение растворов содержащих рчГКСФ и ПЭГи ускоренными электронами приводит к достоверному образованию комплекса ПЭГ-Г-КСФ в независимости от выбранного типа ПЭГа; 2)прочность образующихся связей, а также распределение по молекулярной массе ПЭГ-Г-КСФ, зависят от дозы облучения; 3)в формировании ассоциатов ПЭГ-Г-КСФ в образцах с высокомолекулярными ПЭГами задействован процесс кросслинкинга, индуцированный ускоренными электронами.

2. ИССЛЕДОВАНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПЕГИЛИРОВАННОГО ПОСРЕДСТВОМ ЭЛП ПЭГ-Г-КСФ.

Для исследования фармакологических свойств ПЭГ-Г-КСФ была выбрана композиция рчГКСФ с ПЭГ1500. Факт образования ПЭГ-Г-КСФ подтверждён на хроматограмме и электрофореграмме. Образцы ПЭГ-Г-КСФ, использующиеся в исследованиях по изучению фармакологических свойств были заложены на ускоренное старение при повышенной температуре (термостат 380С) для подтверждения сохранения физико-химических и фармакодинамических свойств.

Таблица 1.Данные по ускоренному хранению ПЭГ-Г-КСФ

0 точка 1 точка 2 точка 3 точка 4 точка В холодильнике за 3 месяца
Дни хранения 0 12 соот-ет 3 месяцам при Т=80С 24 соот-ет 6 месяцам при Т=80С 48 соот-ет 12 месяцам при Т=80С 96 соот-ет 24 месяцам при Т=80С
Падение концентрации г-ксф (% уменьшения площади основного пика г-ксф по ВЭЖХ) 100% 79,9% 74,8% 74,3% 67% 98%
Падение специфической активности 1009% 748% 780% 980%

Представлены в таблице данные свидетельствуют о том, что ЭЛП рчГКСФ, с образованием ПЭГ-Г-КСФ обеспечивает высокую стабильность белка (рчГКСФ) как с точки зрения его физико-химических свойств, так и фармакодинамических эффектов.

Изучение фармакокинетики ПЭГ-Г-КСФ. Абсолютная биологическая доступность (F) препарата при изучаемых путях введения ПЭГ-Г-КСФ рассчитывалась по формуле F=AUCt/AUCp*100%, где AUCt – площадь под фармакокинетической кривой при внутривенном введении препарата, а AUCp – площадь под фармакокинетической кривой в сыворотке при изучаемом пути введения. При этом значение F составляло: 4,3%, 79,5% и 32,1% при внутрижелудочном, подкожном и ректальном введении соответственно. Таким образом, наиболее существенная биодоступность ПЭГ-Г-КСФ при указанных путях введения наблюдается при подкожном использовании препарата. При ректальном введении препарат достаточно быстро попадает в системный кровоток Тmax– 1 час, при этом максимальная концентрация (Cmax) достигает значения 2400 пг (что сопоставимо с максимальными значениями при внутривенном введении препарата), и относительно (по сравнению с внутрижелудочным введением) длительно циркулирует в крови. Так, концентрация препарата при данном способе введения к 5 часу снижалась до исходного уровня (Т1/2=3.3 ч). Подкожное введение ПЭГ-Г-КСФ, по данным исследования, является наиболее адекватной альтернативой внутривенного введения, за исключением параметра Тmax, значение которого составляет 1 час. Величины остальных параметров – период полувыведения, клиренс, площадь под фармакокинетической кривой, либо соответствуют, либо приближаются к таковым при внутривенном введении препарата. Вне зависимости от пути введения ПЭГ-Г-КСФ достаточно быстро достигает системного кровотока. Время достижения максимальных концентраций (Tmax) при подкожном и ректальном введении составило 1 час, а при внутрижелудочном введении 10 мин. Значения максимальных концентраций достигнутых при различных путях введения лежат в диапазоне 1700-2500 пг, включая и внутривенное введение препарата.

Параллельно фармакокинетическому исследованию было проведено изучение биологической (колониестимулирующей) активности сыворотки у животных, получавших ПЭГ-Г-КСФ. Независимо от пути введения препарата в организм животного КСА сыворотки возрастала. Вместе с тем при внутривенном введении препарата КСА возрастала уже к 1 часу после начала эксперимента, к 3 ч достигала наибольших значений показатель и сохранялась повышенной на протяжении последующих 4 ч. В то время как при ректальном введении иммобилизированного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора КСА сыворотки возрастала более плавно, а наиболее значимых величин достигала на 7 ч.

Таблица 2. Сывороточные концентрации КСФ у мышей, после введения препарата, pg/ml

Time, h ПЭГ-Г-КСФ p/о ПЭГ-Г-КСФ s/c ПЭГ-Г-КСФ i/v ПЭГ-Г-КСФ p/r Г-КСФ i/v
0 0,00 0,00 1984,60 0,00 1748,01
0.17 1795,83 1460,83 1904,17 258,33 1575,83
0.5 255,83 1463,33 1653,33 374,17 1993,33
1 170,00 1781,67 1866,67 2416,67 1272,50
3 80,83 1370,83 1824,17 2355,83 1362,50
5 140,00 1380,83 1760,83 143,33 1534,17
7 2,00 1622,50 1546,67 96,67 1574,17
12 6,67 1091,67 1570,00 55,00 1492,50
24 2,00 2,00 33,33 85,83 34,17

Таблица 3

Фармакокинетические показатели ПЭГ-Г-КСФ при введении мышам

в дозе 100 мкг/кг

Путь введения препарата AUC0-t Cmax, пг/мл Tmax, час T1/2 MRT, час Kel, 1/час Cl, л/час
p/о 1284,96 1795,83 0,17 0,4 37,85 1,54 1556,47
s/c 23672,83 1781,67 1,00 8,3 6,99 0,08 84,49
i/v 29792,53 C0=1984,84 10,4 8,52 0,07 67,13
p/r 9559,86 2416,67 1,00 3,3 16,80 0,21 209,21
i/v 27154,56 C0=1748,01 10,8 12,05 0,06 73,65

Примечание: C0 – расчетное значение препарата в нулевой момент времени

Сравнительный анализ концентрации Г-КСФ и КСА сыворотки крови животных в случаях использования препарата внутривенно, подкожно и ректально показал наличие однотипной динамики. В то время как динамика исследуемых показателей при внутрижелудочном введении ПЭГ-Г-КСФ практически не совпадают. Последнее обстоятельство указывает на возможность перераспределения молекул ПЭГ-Г-КСФ в лимфатическом и кровеносном секторах при их прохождении через ЖКТ. Использование ПЭГ-Г-КСФ путем его введения per rectum обеспечивает значительно более существенное всасывание препарата в кровь, чем per os. Полученные данные однозначно свидетельствуют о перспективности данного способа назначения, альтернативного парентеральному применению ПЭГ-Г-КСФ. Также перспективным представляется и энтеральный путь приёма препарата. В исследованиях показано, что биодоступность пегилированной молекулы превышает всасываемость нативного белка более, чем в 3 раза без учёта возможного перераспределения по лимфатическому руслу кишечника (эти исследования не были запланированы в данной работе). Энтеральный путь всасывания демонстрирует проникновение ПЭГ-Г-КСФ в интерстициальное пространство, что в свою очередь, позволяет рассчитывать на применение данного препарата в регенеративной медицине.

Изучение токсического действия ПЭГ-Г-КСФ в остром эксперименте при однократном введении.

Результаты проведенных исследований на мышах. Внутривенное введение. Препарат ПЭГ-Г-КСФ был введен в максимально возможном для данного пути введения объеме – 0,2 мл на 20 г массы животного, что составило 10 мл/кг или 3000 мкг/кг. Внутрижелудочное введение. Препарат ПЭГ-Г-КСФ был введен в максимально возможном для данного пути введения объеме – 1,0 мл на 20 г массы животного, что составило 50 мл/кг или 15000 мкг/кг. Подкожное введение. Препарат ПЭГ-Г-КСФ был введен в максимально возможном для данного пути введения объеме – 1,0 мл на 20 г массы животного, что составило 50 мл/кг или 15000 мкг/кг. Наблюдение за животными в течение 14 дней не выявило никаких изменений внешнего вида, поведения и двигательной активности мышей. При взвешивании мышей в конце эксперимента (через 2 недели) отмечено, что все животные равномерно прибавили в массе.

Результаты проведенных исследований на крысах. Внутривенное введение. Препарат ПЭГ-Г-КСФ был введен в максимально возможном для данного пути введения объеме – 2,0 мл на 200,0 г массы животного, что составило 10 мл/кг или 3000 мкг/кг. Подкожное введение. Препарат ПЭГ-Г-КСФ был введен в максимально возможном для данного пути введения объеме – 5,0 мл на 200,0 г массы животного, что составило 25,0 мл/кг или 7500 мкг/кг. Внутрижелудочное введение. Препарат ПЭГ-Г-КСФ был введен в максимально возможном для данного пути введения объеме – 5,0 мл на 200,0 г массы животного, что составило 25,0 мл/кг или 7500 мкг/кг. Наблюдение за животными в течение 14 дней не выявило никаких изменений внешнего вида, поведения и двигательной активности мышей. При взвешивании мышей в конце эксперимента (через 2 недели) отмечено, что все животные равномерно прибавили в массе.

Анализ полученных результатов изучения острой токсичности позволил установить, что однократное введение ПЭГ-Г-КСФ в крысам и мышам внутривенно, подкожно и внутрижелудочно в максимально возможном для данного пути введения объеме не оказывает токсического действия на организм животных при наблюдении за ними в течение 14 дней.

Таблица 4.

Параметры острой токсичности ПЭГ-Г-КСФ при однократном введении мышам и крысам, мл/кг (мкг/кг)

Вид, пол животных, способ введения LD50
Мыши (самцы и самки) Внутривенно Внутрижелудочно Подкожно >10,0 (3000 мкг) >50,0 (15000 мкг) >50,0 (15000 мкг)
Крысы (самцы и самки) Внутривенно Подкожно Внутрижелудочно >10,0 (3000 мкг) >25,0 (7500 мкг) >25,0 (7500 мкг)

Выявленные параметры острой токсичности ПЭГ-Г-КСФ на мышах и крысах при разных путях введения (внутривенно, подкожно и внутрижелудочно), не позволяют точно определить значение LD50 для изученной фармакологической композиции из-за невозможности достижения больших концентраций препарата. Условно данное вещество можно отнести в соответствии с ГОСТ 12.1.007–76 (по внутрижелудочному пути введения), к классу менее второго класса опасности, хотя это не дает полной характеристики безопасности. Достигнутые дозы при определении токсичности многократно превышают терапевтические, применяемые в клинической практике - от 300 до 1500 раз.

Изучение общетоксического действия в течение 6 месяцев (хроническая токсичность). Введение ПЭГ-Г-КСФ в дозах 50 и 250 и 500 мг/кг внутрижелудочно в течение 6 мес. не вызывало гибели животных; крысы не проявляли признаков беспокойства, не были выявлены изменения аппетита, выделений, состояния слизистых, шерсти, кожи и др. Отмеченное обратимое снижение процента прироста массы тела у крыс-самок не приводило к значимому изменению средней массы животных экспериментальных групп в сравнении с контрольными значениями.

Влияние ПЭГ-Г-КСФ на показатели форменных элементов периферической крови. Анализ полученных результатов у крыс (самцов и самок) через 3 и 6 мес. внутрижелудочного введения ПЭГ-Г-ГКСФ в трех дозах выявил ряд умеренных изменений со стороны показателей периферической крови. Через 3 мес. опыта следует отметить у крыс-самцов повышение гематокритного числа в 1 группе, повышение числа эритроидных клеток и снижение количества незрелых лейкоцитов во 2 группе и снижение общего количества лейкоцитов в 3 группе за счет падения числа зрелых и незрелых лейкоцитов и моноцитов. У крыс-самок во 2 группе отмечено повышение СОЭ, в 3 группе – эозинофильных лейкоцитов и снижение числа моноцитов. Через 6 мес. введения ПЭГ-Г-КСФ следует отметить развитие эритропении и снижение уровня гемоглобина в 1 группе крыс-самцов, тромбоцитопении - во 2 и 3 группе, и снижения ОКЛ во 2 группе. У крыс-самок при введении препарата увеличивалось СОЭ в 1 и 2 группах, снижалось ОКЛ, за счет падения числа моноцитов и лимфоцитов, в 1 группе. Через 2 недели после отмены введения ПЭГ-Г-КСФ не было отмечено никаких изменений в картине периферической крови ни в одной из экспериментальных групп.

Таким образом, внутрижелудочное введение в течение 3-х месяцев крысам ПЭГ-Г-КСФ в дозах 50, 250 и 500 мг/кг не вызывает патологических изменений основных показателей форменных элементов периферической крови. Выявленные изменения ряда показателей периферической крови через 3 и 6 мес. введения препарата носят обратимый характер.

3. ИССЛЕДОВАНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПЭГ-П.

Физико-химические свойства ПЭГ-П. Молекулярная масса 27,7 кДа, 275 аминокислотных остатков. На рисунке 7 представлены данные электрофореза в 12,5% ПААГ-Геле с окраской нитратом серебра ПЭГ-П, культуральной жидкости (к/ж) из которой экстрагируется протеиназа ПЭГ-П и Декозима. Очевидно, что ПЭГ-П имеет высокую степень выделения и последующей очистки.

Рис. 7. Электрофорез в 12,5% ПААГ-Геле с окраской нитратом серебра. Примечание 1 – Декозим 13мкг/лунка; 2 – ПЭГ-П 20мкг/лунка; 3 –к/ж 24мкг/лунка

Рис.8. SDS-ПААГ- электрофорез в 10% а/а геле. Примечание: 1-Субстанция ПЭГ-П с230209 20мкг/лунка; 2-Субстанция ПЭГ-П с240209 20мкг/лунка; 3-Субстанция ПЭГ-П с250209 20мкг/лунка; 4-Субстанция ПЭГ-П с270209 20мкг/лунка; 5-Субстанция ПЭГ-П с280209 20мкг/лунка; 6-Субстанция ПЭГ-П с290209 20мкг/лунка; 7-Субстанция ПЭГ-П с300309 20мкг/лунка; 8-Субстанция ПЭГ-П с310309 20мкг/лунка; 9-Субстанция ПЭГ-П с30409 20мкг/лунка; 10-Субстанция ПЭГ-П с40409 20мкг/лунка.

ПЭГ-П имеет стабильные физико-химические свойства при соблюдении условий хранения, предусмотренных для ферментных препаратов. Лекарственный препарат ПЭГ-П имеет заявленные производителем сроки хранения 2 года для твёрдой лекарственной формы и 18 месяцев для лиофилизата (ФСП 42-0562656805, ФСП 42-0562569804).

Исследование тромболитической активности IN VITRO.

Исследование фибринолитической активности ПЭГ-П. Полученные результаты свидетельствуют о наличии прямого фибринолитического действия препарата ПЭГ-П на нестабилизированный фибрин «in vitro» в концентрациях 5,0 и 10,0 Ед/мл. При использовании же более высоких кон­центраций ПЭГ-П проявляется его противосвертывающая активность, выражающаяся в уменьшении размеров сгустка или отсутствии его образования. На модели лизиса тромба in vitro отмечено, что ПЭГ-П обладает выраженным тромболитическим действием, достоверно превосходящим фибринолизин в стандартной лечебной концентрации – 50 ФЕ/мл (p<0,02), трипсин (p<0,01) и спонтанный лизис тромба в физиологическом растворе (p<0,01). В течение первых двух часов действие фибринолизина на тромб достоверно не отличается от спонтанного фонового лизиса в физиологическом растворе. К концу 4-го часа ПЭГ-П полностью растворяет тромб, в то время как фибринолизин за это время лизирует только 20 % массы «старого» тромба.

Исследование антиагрегантной активности ПЭГ-П. Исходная агрегация тромбоцитов в данной серии экспериментов составила 32±2%. После добавления в плазму ПЭГ-П в концентрациях 0,1, 0,2 и 0,3 ПЕ/мл наблюдалось достоверное снижение степени агрегации на 41%, 25% и 19% соответственно по отношению к контролю. С увеличением дозы ПЭГ-П прослеживалась тенденция к восстановлению значений агрегации тромбоцитов. Так при добавлении ПЭГ-П в концентрации 0,4 ПЕ/мл агрегация составила 33±1%, в концентрации 0,5 ПЕ/мл - 34±1%, в концентрации 1,0 ПЕ/мл - 31±1, что не отличалось от контрольного показателя. ПЭГ-П в низких концентрациях (0,1-0,3 ПЕ/мл) приводит к достоверному снижению агрегации тромбоцитов при действии АДФ (1.10-6 М). В диапазоне концентраций ПЭГ-П от 0,4 до 1,0 ПЕ/мл агрегация тромбоцитов находится на уровне, близком к исходному.

Электрокоагулографическое исследование цельной крови. Как видно из представленного графического материала, курсовой прием препарата обеспечивает статистически значимое снижение контактной фазы свертывания крови с 318±19 до 178±21, увеличение времени её достижения с 1,1±0,3 мин до 3,2±0,4 мин (р‹0,5). При этом выражено снижается интенсивность контактной фазы коагуляции с -141,82±13,21 до 18,13±6,27 (р‹0,5) и константа тромбиновой активности с 58,82±4,37 до 23,81±3,36 (р‹0,5). Эти изменения регистрируются на фоне снижения интенсивности коагуляционного драйва с 41,89±2,35 до 25,34±3,12 (р‹0,5) и увеличения времени свертываемости цельной крови с 3,7±0,1 мин до 10,3±1,1 мин (р‹0,5). Полученные результаты полностью подтверждают эффективность применяемого препарата в отношении не только его фибринолитической активности, но и в отношении снижения прокоагулянтной активности в тромбоцитарно-сосудистом и прокоагулянтном звеньях гемостаза.

Рисунок 9. Суммарные гемокоагулограммы, полученные у пациентов с ИБС: стенокардия напряжения I-II ФК, НК 0-I до (верхний график) и после (средний график) курсового приема препарата ПЭГ-П. Нижний график – 120 минут после приема 800 ЕД препарата ПЭГ-П.

Приведенный на рисунке 9 нижний график, полученный в пробах цельной крови пациентов ИБС: стенокардия напряжения I-II ФК, НК 0-I на 120 минуте после приема 800 ЕД препарата ПЭГ-П демонстрирует эффекты препарата in vitro. В анализируемой пробе цельной крови, содержащей аликвоту поступившего в системный кровоток препарата, в результате контактной активации запускается каскадный процесс гемокоагуляции, где, через образование тромбина, конечным этапом выступает формирование фибринового сгустка. Но, как видно из «поведения» графика гемокоагулограммы, концентрации перорального фибринолитика, содержащегося в анализируемом объеме цельной крови, оказывается достаточно для выраженного торможения фибринообразования, что подтверждается волнообразными изменениями кривой лишь с постепенным приростом её амплитуды. Косвенным образом это подтверждает гипотезу о постепенном высвобождении активного начала – ПЭГ-П из пегелированной структуры.

Таким образом, по результатам исследования курсового приема препарата ПЭГ-П в суточной дозе 1600 ЕД показано достижение выраженной эффективности в отношении повышения резервных возможностей антикоагулянтного звена гемостаза и снижения агрегационной активности тромбоцитов на фоне оптимизации соотношения ряда цитокинов, ответственных за реализацию про- и противовоспалительной активностей.

Исследование фармакологических свойств IN VIVO.

Исследование влияния ПЭГ-П на фибринолитическую систему крови.У животных контрольной группы время спонтанного лизиса сгустка, получаемого из эуглобулиновой фракции плазмы при добавлении к ней хлорида кальция, достигало 229±17 мин. У крыс, получавших ПЭГ-П, через час после введения время лизиса сгустка снизилось в 1,4 раза и составило 162±23 мин, что статистически значимо меньше, чем в контрольной группе.

Исследование гемореологической активности. У животных, получавших ПЭГ-П через 1 час после введения препарата наблюдалось достоверное повышение вязкости крови (на 10-25% по сравнению с контрольной группой) во всем исследуемом диапазоне скоростей сдвига. Вместе с тем на этом фоне выявлено статистически значимое снижение вязкости плазмы до 1,29±0,02 сПз. При введении ПЭГ-П значение гематокрита увеличивалось до 44±1% и являлось достоверно более высоким по сравнению с контрольными крысами (38±1%). Под действием препарата полупериод агрегации эритроцитов возрастал в 2,3 раза (до 28,3±5,4 с), что свидетельствует об ослаблении процессов эритроцитарной агрегации.

Исследование тромболитической активности при профилактическом введении. Профилактическое введение ПЭГ-П эффективно ограничивает процесс тромбообразования в сонной артерии в первые 1,5 часа после воздействии на нее хлоридом двухвалентного железа и уменьшает количество тромбов через 24 часа.

Исследование тромболитической активности ПЭГ-П при лечебном введении. При терапевтическом введении ПЭГ-П а через 24 часа достоверно и существенно (в 3 раза) снижается доля животных с полной окклюзией сонной артерии и наличием в ней тромба, что свидетельствует о выраженной тромболитической активности препарата при лечебном применении.

Исследование тромболитической активности энтеральной формы ПЭГ-П при лечебно-профилактичексом введении. Тромболитическое действие ПЭГ-П при внутрижелудочном введении в дозе 1000 ЕД/кг по лечебно-профилактической схеме в половине опытов вызывало реканализацию общей сонной артерии у крыс и способствовало снижению массы тромба при тромбоокклюзии, вызванной аппликацией хлорида двухвалентного железа.

Исследование антиагрегантной активности. ПЭГ-П, вводимый в дозе 10 ПЕ/кг внутривенно и 70 ПЕ/кг внутрибрюшинно, достоверно не изменял степень агрегации тромбоцитов.

Исследование фармакокинетики ПЭГ-П при энтеральном введении. В данном эксперименте установлено, что ПЭГ-П имеет достаточно большую для крупной белковой молекулы биодоступность (17%) и длительное время достижения максимальной концентрации в кровотоке (5 часов). Колоколообразный тип фармакокинетической кривой ПЭГ-П позволяет предполагать высокую способность ПЭГ-П накапливаться в интерстиции и лимфатическом русле (что было впоследствии определено).

РиРисунок10. Фармакокинетическая кривая ПЭГ-П при внутрижелудочном введении. По оси абсцисс – время (ч), по оси ординат – концентрация ПЭГ-П в сыворотке крови (ЕД/мл)

Таблица 5

Фармакокинетические параметры ПЭГ-П при внутрижелудочном введении

Параметры
Значения
AUC, ЕД·ч/мл (нулевой момент) 0,132
AUMC, ЕД·ч2/мл (первый момент) 0,640
AUMMC, ЕД·ч3/мл (второй момент) 0,778
Тmax, ч (время достижения максимальной концентрации) 5
Сmax, Ед/мл (максимальная концентрация) 0,044
Clро, мл/ч (клиренс) 6,792
Kel, 1/ч (константа элиминации) 5,319
T1/2, ч (период полувыведения) 0,43
MRTро, ч (среднее время удержания) 4,832
Vpо, л (объем распределения) 1,277
F (доля всосавшегося препарата) 0,17

Исследование фармакокинетики при внутривенном введении

Таблица 6

Фармакокинетические параметры ПЭГ-П при внутривенном введении

Параметры Значения
AUC, ЕД·мин/мл (нулевой момент) 4,91
AUMC, ЕД·мин2/мл (первый момент) 56,71
AUMMC, ЕД·мин3/мл (второй момент) 1747,41
Cд, мл (общий клиренс) 1,2
Kel, 1/мин (константа элиминации) 0,057
T1/2, мин (период полувыведения) 12,27
MRT, мин (среднее время удержания) 11,56
MRT0, мин (среднее время удержания в центральном пуле) 8,03
MRTp, мин (среднее время удержания в периферическом пуле) 3,53
Vss, мл (стационарный объем распределения) 14,1
V0, мл (центральный объем распределения) 9,8
Vp, мл (периферический объем распределения) 4,3
C0, ЕД/мл (начальная концентрация) 0,61


Pages:   || 2 |
 
Похожие работы:

«ЗАСЫПКИНА ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА СОЦИАЛЬНЫЙ СТАТУС И ПРОФЕССИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ МЕДИЦИНСКОЙ СЕСТРЫ В ПРОЦЕССЕ РЕФОРМЫ ОТЕЧЕСТВЕННОГО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ 14.02.05 – социология медицины АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград – 2013 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского Минздрава России Научный...»

«ЛЯШКО Виталий Владимирович ОПТИМИЗАЦИЯ ХИРУРГИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ ПАЦИЕНТОВ ПОЖИЛОГО И СТАРЧЕСКОГО ВОЗРАСТА С ОСТРЫМ ВОСХОДЯЩИМ ВАРИКОТРОМБОФЛЕБИТОМ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ 14.01.30  – геронтология и гериатрия 14.01.17  – хирургия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург – 2010 Работа выполнена в отделе возрастной патологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, ФГУЗ Клинической больнице №122 им. Л.Г....»

«ЕЛФИМОВ ПАВЕЛ ВАСИЛЬЕВИЧ Научное обоснование современных технологий и организации травматологической помощи в мног о профильной больнице 14.00.33 – Общественное здоровье и здравоохранение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук Москва – 2010 Работа выполнена на базе Государственного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования Уральский научно-практический центр медико-экономических и социальных проблем...»

«Нанкина Ирина Аркадьевна КОГНИТИВНЫЕ НАРУШЕНИЯ ПРИ РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ 14.01.11 – Нервные болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва-2010 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Научный руководитель : доктор медицинских наук,...»

«КОНОВАЛОВА Ольга Станиславовна КРИТЕРИИ РАННЕГО ВЫЯВЛЕНИЯ ЮВЕНИЛЬНОЙ ГЛАУКОМЫ У ДЕТЕЙ С ПРОГРЕССИРУЮЩЕЙ МИОПИЕЙ 14.01.07 – глазные болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2011 Работа выполнена на кафедре офтальмологии ФПК и ППС Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Тюменская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию...»

«ТАМАЗЯН ГАЯНЕ ВАРТАНОВНА Резервы обеспечения прироста и оптимизации здоровья детской популяции в современных социально-экономических усло виях региона Московской области 14.01.08 – педиатрия 14.02.03 – общественное здоровье и здравоохранение Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва, 2010 Работа выполнена в ФГУ Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава Научные консультанты:...»

«Печерица Оксана Григорьевна РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ НИЗКОРОСЛОСТИ И СТГ-ДЕФИЦИТА У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ В РЕСПУБЛИКЕ ТАТАРСТАН, ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ Специальность 14.00.03 – Эндокринология. Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Казань - 2010 Работа выполнена в ГОУ ВПО Казанский государственный медицинский университет Росздрава Научный руководитель : заслуженный врач РТ, кандидат медицинских наук, доцент Султанова Людмила Мутиговна...»

«РЕМЕСЛО Марина Борисовна КЛИНИКО-ЛИНГВИСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ БОЛЬНЫХ НЕВРОЗАМИ И ИХ ДИНАМИКА В ПРОЦЕССЕ ПСИХОТЕРАПИИ Специальность: 14.00.18 — психиатрия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург 2007 Работа выполнена в ГУ Санкт-Петербургский научно-исследовательский психоневрологический институт им. В.М. Бехтерева Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Научный руководитель: кандидат медицинских...»

«куркин денис ВЛАДИМИРОВИЧ Церебропротекторные свойства композиций фенибута с некоторыми органическими кислотами при нарушениях мозгового кровообращения 14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук ВОЛГОГРАД – 2013 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Волгоградский государственный медицинский университет Министерства...»

«Девяткин Андрей Николаевич ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ СТРОЕНИЕМ СТОПЫ И ХРОНИЧЕСКОЙ ВЕНОЗНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ 14.03.01 – анатомия человека Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград 2013 Работа выполнена в ГБОУ ВПО Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Александр Александрович Воробьев Научный...»

«ГОБЕДЖИШВИЛИ ВАХТАНГ ВЛАДИМИРОВИЧ ПРОФИЛАКТИКА ПОСЛЕОПЕРАЦИОННЫХ ВНУТРИБРЮШНЫХ СПАЕК У ПАЦИЕНТОВ С КИШЕЧНОЙ НЕПРОХОДИМОСТЬЮ Н Е ОПУХОЛЕВОГО ГЕНЕЗА 14.01.17 – хирургия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Ставрополь – 2013 Работа выполнена в ГБОУ ВПО Ставропольская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Лаврешин Петр Михайлович...»

«ШКЛЯЕВ АЛЕКСЕЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ МЕДИКАМЕНТОЗНОГО И...»

«УДК 618.11 - 006.2 Макарищев Алексей Яковлевич КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА ПРИ СИНДРОМЕ ПОЛИКИСТОЗНЫХ ЯИЧНИКОВ 14.00.01 – Акушерство и гинекология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва - 2007 Работа выполнена в ГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Геворкян Марианна Арамовна Официальные...»

«УРУКОВ ЮРИЙ НИКОЛАЕВИЧ КОМПЛЕКСНОЕ МЕДИКО-ПРАВОВОЕ, ЭКСПЕРТНОЕ И КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНЫХ ОШИБОК И НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ ИСХОДОВ ПРИ ОКАЗАНИИ ОРТОПЕДИЧЕСКОЙ СТОМАТОЛОГИЧЕСКОЙ ПОМОЩИ. 14.00.24 - СУДЕБНАЯ МЕДИЦИНА 14.00.21 - СТОМАТОЛОГИЯ АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА МЕДИЦИНСКИХ НАУК Москва - 2008 Работа выполнена в ГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава и в ГОУ ВПО Нижегородская медицинская...»

«Шпилевой Виктор Викторович Чрескожная радиочастотная деструкция при лечении болевых синдромов у пациентов с коксартрозом и тригеминальной невралгией 14.00.22 - травматология и ортопедия 14.00.28 – нейрохирургия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Курган 2001 Работа выполнена в городской больнице № 5 г. Тольятти и Российском научном центре Восстановительная травматология и ортопедия имени академика Г.А. Илизарова (Генеральный директор...»

«Позмогова Наталья Павловна Комплексное социально-гигиеническое и с следование ВИЧ-инфицированных и их семей 14.00.33 – общественное здоровье и здравоохранение Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва-2007 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ижевская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Научный...»

«Сельващук Андр ей Петрович РЕКОНСТРУКЦИЯ И ЭНДОПРОТЕЗИРОВАНИЕ ТРАХЕОБРОНХИАЛЬНОГО ДЕРЕВА ПРИ ДОБРОКАЧЕСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ И ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ПОРАЖЕНИЯХ 14.00.27 - хирургия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Краснодар – 2009 Работа выполнена в Кубанском государственном медицинском университете (КГМУ). Научный консультант: доктор медицинских наук профессор Порханов Владимир Алексеевич....»

«Раздорский Владимир Викторович Внутрикостные с памятью формы и накостные имплантаты в лечении БОЛЬНЫХ С АДЕНТИЕЙ верхней челюсти 14.00.21 – Стоматология АВТОРЕФЕРАТ...»

«Рязанов Виталий Дмитриевич Оценка антиоксидантного статуса и оптических спектров гемоглобина для диагностики клинических форм хронического тонзиллита 14.01.03 – болезни уха, горла и носа АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2012 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Оренбургская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и...»

«Шарвадзе Георгий Гелаевич Выявление андрогенного дефицита у мужчин с высоким сердечно-сосудистым риском: оценка влияния заместительной терапии андрогенами на основные факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний 14.01.05 – кардиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2012 Работа выполнена в ФГБУ Государственный научно-исследовательский центр профилактической медицины Минздрава России На учный руководитель: доктор...»








 
2014 www.avtoreferat.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.